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Radeaux de protéines sur la bicouche phospholipidique

Radeaux de protéines sur la bicouche phospholipidique


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L'un d'entre vous connaît-il le nom spécifique des radeaux de protéines qui permettent aux protéines de flotter sur une double couche de phospholipides (membrane cellulaire) ? Je pense juste qu'il devrait y avoir un autre nom plutôt que simplement "radeau de protéines".


Ces conglomérats de protéines, de glycolipides et de cholestérol sont généralement appelés radeaux lipidiques. (Google Scholar affiche 84 000 résultats pour ce terme, contre 400 pour « radeau de protéines ».) Voici un schéma d'un radeau lipidique :

(Légende : A : espace intracellulaire ou cytosol, B : espace extracellulaire ou lumière de l'appareil de Golgi/vésicule. 1 : Membrane non-radeau. 2 : Rateau lipidique. 3 : Protéine transmembranaire associée au radeau lipidique. 4 : Protéine membranaire non-radeau. 5 : Modifications de la glycosylation (sur les glycoprotéines et les glycolipides). 6 : Protéine ancrée GPI. 7 : Cholestérol. 8 : Glycolipide) [de Wikimedia Commons]

Comme cela l'illustre, les radeaux lipidiques flottent dans la bicouche lipidique membranaire, pas "au-dessus" ou "au-dessus". Le radeau est une partie de la membrane, pas quelque chose à l'extérieur ou sur un seul côté de celle-ci. Le radeau est libre de se déplacer dans les deux dimensions environnantes de la membrane.

On pourrait argumenter que « radeau de protéines » pourrait être un meilleur nom que « radeau lipidique » puisque nous appellerions un radeau commun un « radeau de bois » ou « radeau de papyrus », mais généralement pas un « radeau d'eau ». Quelle que soit la valeur d'un tel argument, « radeau lipidique » est le terme utilisé.


Il n'y a pas de radeaux de protéines qui « flottent » sur une bicouche. Il existe des protéines qui insèrent des domaines dans les bicouches, ou les traversent, ou se lient aux groupes de tête lipidiques. Il existe également d'autres protéines qui se lient à ces protéines.


Protéine de la membrane périphérique

Protéines membranaires périphériques sont des protéines membranaires qui n'adhèrent que temporairement à la membrane biologique à laquelle elles sont associées. Ces protéines se fixent à des protéines membranaires intégrales ou pénètrent dans les régions périphériques de la bicouche lipidique. Les sous-unités protéiques régulatrices de nombreux canaux ioniques et récepteurs transmembranaires, par exemple, peuvent être définies comme des protéines membranaires périphériques. Contrairement aux protéines membranaires intégrales, les protéines membranaires périphériques ont tendance à s'accumuler dans le composant soluble dans l'eau, ou fraction, de toutes les protéines extraites au cours d'une procédure de purification des protéines. Les protéines avec des ancres GPI font exception à cette règle et peuvent avoir des propriétés de purification similaires à celles des protéines membranaires intégrales.

Il a été démontré que la fixation réversible des protéines aux membranes biologiques régule la signalisation cellulaire et de nombreux autres événements cellulaires importants, par le biais de divers mécanismes. [1] Par exemple, l'association étroite entre de nombreuses enzymes et membranes biologiques peut les rapprocher de leur(s) substrat(s) lipidique(s). [2] Liaison à membrane peuvent également favoriser un réarrangement, une dissociation ou des changements de conformation au sein de nombreux domaines structuraux de protéines, entraînant une activation de leur activité biologique. [3] [4] De plus, le positionnement de nombreuses protéines est localisé soit sur les surfaces internes ou externes, soit sur les feuillets de leur membrane résidente. [5] Cela facilite l'assemblage de complexes multiprotéiques en augmentant la probabilité de toute interaction protéine-protéine appropriée.


Biologie Chapitre 11

Toutes les cellules sont séparées de l'environnement extracellulaire par la membrane plasmique. Cette membrane cellulaire joue un rôle clé dans la communication cellulaire, en présentant des signaux qui relient des informations sur l'état de la cellule, y compris sa santé relative. Dans les cellules saines, la distribution des phospholipides dans la membrane plasmique est asymétrique. Certains phospholipides, tels que la phosphatidylcholine et la sphingomyéline, sont confinés à la moitié non cytosolique de la membrane plasmique, tandis que d'autres tels que la phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine ne sont présents que dans la monocouche cytosolique de la membrane.

Lorsque les cellules ne sont plus nécessaires ou sont endommagées de manière irréparable, elles peuvent activer une forme de mort cellulaire programmée appelée apoptose. Une cellule en apoptose se détruit activement de l'intérieur, digérant ses protéines et dégradant son ADN. Il affiche également des signaux qui dirigent les cellules phagocytaires circulantes pour engloutir ses restes.

L'un de ces signaux implique la relocalisation de la phosphatidylsérine. Une cellule apoptotique affiche de la phosphatidylsérine - normalement confinée à la monocouche cytosolique de la membrane plasmique - à sa surface.

Cette inversion implique la manipulation de l'activité des flippases et des scramblases dans la membrane plasmique. Premièrement, la scramblase qui transfère les phospholipides aléatoires d'une monocouche de la membrane plasmique à l'autre doit être activée. Ce brouillage provoque la distribution de la phosphatidylsérine - initialement déposée dans la monocouche cytosolique - dans les deux moitiés de la bicouche. En même temps, la flippase qui transférerait normalement la phosphatidylsérine de la monocouche extracellulaire à la monocouche cytosolique doit être inactivée. Ensemble, ces actions provoquent une accumulation rapide de la phosphatidylsérine à la surface cellulaire.

L'augmentation de l'activité des flippases provoque le transfert sélectif de la phosphatidylsérine vers la moitié cytosolique de la membrane. Cette distribution est le signe d'une cellule saine, à l'opposé de ce qui se passe lorsque les cellules subissent une mort cellulaire programmée.


1.2 Caractéristiques des membranes

L'environnement natif des protéines membranaires est dynamique et asymétrique, décrit par Singer et Nicolson comme fluide et mosaïque dans leur modèle de 1972 qui est devenu le paradigme de la structure membranaire (Figure 1.1). 4 Les lipides constitués de groupes de tête polaires et de chaînes acyles non polaires forment une bicouche fluide bidimensionnelle (Figure 1.2). La composition lipidique est diversifiée, la plupart des lipides étant distribués de manière aléatoire dans la phase de masse de la bicouche tandis que certains sont localisés par des interactions spécifiques avec des protéines et/ou d'autres lipides, souvent dans des régions de lipides ordonnés appelées radeaux (voir ci-dessous).

Dans la phase lipidique désordonnée (Ld, également appelée Lα), la fluidité de la bicouche résulte du mouvement constant et varié des lipides (Figure 1.3). Bien que la vitesse de diffusion latérale dans les bicouches lipidiques pures soit très rapide, la mobilité mesurée des lipides en vrac à la surface des cellules est beaucoup plus lente. Cette différence a été expliquée par le suivi d'une seule particule à la surface des cellules contenant des cytosquelettes : les trajectoires des molécules uniques sont rapides dans de petites régions, où elles sont confinées jusqu'à ce qu'elles sautent dans une région contiguë, produisant une progression globale plus lente. 5

La distribution en mosaïque des protéines membranaires résulte de grandes variations de mobilité latérale, de celles qui diffusent rapidement en surface à celles ancrées par le cytosquelette. Une grande partie des protéines membranaires fonctionnent dans des assemblages de protéines, qui ont eux-mêmes des durées de vie variables. Certains complexes de protéines membranaires sont très stables, comme les complexes respiratoires impliqués dans la transduction énergétique (voir ci-dessous), tandis que d'autres sont le résultat d'interactions transitoires telles que celles impliquées dans la transduction du signal. De nombreuses protéines à ancrage lipidique sont observées dans des radeaux membranaires enrichis en sphingomyéline et en cholestérol à l'état d'ordre lipidique (Lo) (voir Figure 1.2). La présence de radeaux variant en taille (diamètres de 10 à 200 nm) et en durée (de <1 ms à des durées de vie assez stables) améliore les distributions non aléatoires et les interactions dynamiques dans la membrane. 6 Les interactions lipide-lipide entraînent probablement la formation de radeaux, étant donné que même de simples mélanges de lipides révèlent l'immiscibilité des fluides (figure 1.4). Les anneaux hydrocarbonés fusionnés du cholestérol sont presque rigides, permettant au stérol de s'aligner avec les lipides contenant des chaînes acyles saturées, en particulier les sphingomyélines, et de favoriser le compactage serré de la phase Lo.


Structure et fonction de la membrane

Les membranes sont vitales car elles séparent la cellule du monde extérieur. Ils séparent également des compartiments à l'intérieur de la cellule pour protéger les processus et événements importants.

Les membranes cellulaires ont des fonctions diverses dans les différentes régions et organites d'une cellule. Cependant, au niveau microscopique électronique, ils partagent une structure commune suivant les étapes préparatoires de routine. La figure ci-dessus montre la membrane « Unit » typique. qui ressemble à une voie ferrée avec deux lignes denses séparées par un espace dégagé. Cette figure montre en fait deux membranes plasmiques adjacentes, qui ont toutes deux la structure « membrane unitaire ».

(Figure ci-dessus tirée de Bloom et Fawcett, A Textbook of Histology, Chapman et Hall, N.Y., 12e édition, 1994, Figure 1-2.)

Pour préparer cette partie de la discussion sur les membranes, lisez les pages 477-488 de votre texte

(Alberts et al. Biologie moléculaire de la cellule, Garland Publishing, N.Y. Troisième édition, 1994.)

Comment les premiers biologistes cellulaires ont-ils déduit la structure des membranes à partir d'images au microscope électronique et de la connaissance que les membranes étaient des complexes lipoprotéiques ?

Notez le matériau qui dépasse de la membrane plasmique à l'intérieur et à l'extérieur de la cellule. Que pensez-vous que c'est? De plus, l'extérieur de la cellule se trouve dans la moitié supérieure de la photo. Pouvez-vous trouver une vésicule avec une structure membranaire unitaire ?

Une perspective historique

Au début des années 30-40, Danielli et Davson ont étudié les bicouches lipidiques de triglycérides sur une surface d'eau. Ils ont constaté qu'ils se sont arrangés avec les têtes polaires tournées vers l'extérieur. Cependant, ils formaient toujours des gouttelettes (huile dans eau) et la tension superficielle était beaucoup plus élevée que celle des cellules. Cependant, si vous ajoutiez des protéines, la tension superficielle était réduite et les membranes aplaties.

Voici un schéma de leur premier modèle de la membrane cellulaire.

Quelles fonctions membranaires pourraient être permises par ce modèle ?

Dans les années 1950, Robertson a noté la structure des membranes observées dans les micrographies électroniques ci-dessus. Il n'a vu aucun espace pour les pores dans les micrographies électroniques. Il a émis l'hypothèse que l'apparence de la voie ferrée provenait de la liaison du tétroxyde d'osmium aux protéines et aux groupes polaires de lipides.

Que manque-t-il dans le modèle de Robertson ?

En 1966, Lenard et Singer ont noté que plus de 30% des protéines membranaires étaient tordues en une hélice alpha. Cela a rendu probable qu'il y avait beaucoup de protéines sphériques.

Peut-on construire un modèle Davson-Danielli ou Robertson avec des protéines sphériques ? Qu'adviendrait-il de la taille de la membrane?

De plus, que se passerait-il si vous dépliiez les protéines, exposant des groupes non polaires (chaînes latérales d'acides aminés hydrophobes) à l'environnement aqueux ?

Quel type d'énergie la cellule devrait-elle dépenser pour maintenir les protéines aplaties dans cet état ?

Singer a étudié les bicouches phospholipidiques et a découvert qu'elles peuvent former une surface aplatie sur l'eau, sans avoir besoin d'une couche de protéines. Le tournant dans la modélisation est venu avec l'avènement des techniques de fracture par congélation. Cette figure montre l'intérieur d'une membrane et les "bosses, rainures, crêtes". Il s'est avéré plus tard qu'il s'agissait de protéines.

Quelles conclusions pourriez-vous tirer sur la structure de la membrane à partir de la photo de gauche ?

Membrane de base Architecture Le but de cette présentation sera de montrer comment les membranes sont étudiées par le biologiste cellulaire. Tout d'abord, nous examinerons l'architecture de base de la membrane unitaire. Toutes les membranes contiennent des protéines et des lipides. Cependant, la proportion de chacun varie en fonction de la membrane. Par exemple : la myéline, qui isole les fibres nerveuses, ne contient que 18 % de protéines et 76 % de lipides. Une micrographie électronique de la myéline se trouve à droite. La membrane interne mitochondriale contient 76% de protéines et seulement 24% de lipides. Les membranes plasmiques des globules rouges humains et du foie de souris contiennent des quantités presque égales de protéines (44, 49 % respectivement) et de lipides (43, 52 % respectivement). Compte tenu de ce que vous savez déjà sur ces cellules ou organites, quelle serait la signification de ces différentes proportions de lipides et de protéines ?

Comme nous l'avons dit plus haut, l'architecture membranaire est celle d'une bicouche lipidique. Les lipides sont amphipathiques en ce qu'ils ont des têtes polaires hydrophiles en rappel et la partie hydrophobe formant le noyau.

En plus de cette figure, consultez votre texte (Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, Third edition, Garland Publishing, N.Y. 1994) à la page 55 pour une caricature d'une bicouche lipidique formée de phospholipides et de glycolipides. Ces chiffres sont tirés de votre texte, Figure 10-1, page 477. Les protéines sont intégrées dans la bicouche. Ils peuvent traverser la bicouche (en tant que protéines transmembranaires), ou ils peuvent être insérés au niveau de la face cytoplasmique ou extérieure.

Une coupe transversale de la bicouche est vue sur cette figure. Comme nous le verrons plus en détail ci-dessous, les molécules lipidiques ont une tête globulaire (polaire) et une région rectiligne (non polaire). Chaque rangée de lipides est un feuillet. Par conséquent, la membrane plasmique se compose de deux feuillets avec les régions non polaires dirigées vers l'intérieur.

Démontons la membrane et examinons chacun de ses composants. L'un des principaux types de lipides dans la membrane comprend les phospholipides. Ceux-ci ont un groupe de tête polaire et deux queues d'hydrocarbures. Un exemple d'un phospholipide est montré dans cette figure (à droite). La région supérieure commençant par le NH3 est le groupe polaire. Il est relié par le glycérol à deux queues d'acides gras. L'une des queues est un acide gras à chaîne droite (saturé). L'autre a un pli dans la queue à cause d'une double liaison cis (insaturée). Ce pli influence le tassement et le mouvement dans le plan latéral de la membrane. La figure de gauche est modifiée de

Alberts et al. Biologie moléculaire de la cellule, Garland Publishing, N.Y., 1994, troisième édition, figure 10-10.

La figure ci-dessous est de Wolfe S.L., Biologie moléculaire et cellulaire, Wadsworth Publishing Company, 1993, p 155.

La figure de ce paragraphe montre comment les phospholipides se regroupent dans les deux feuillets de la membrane. La présence de la double liaison cis empêche un tassement serré et rend la bicouche difficile à congeler. Chiffre modifié de

Alberts et al. Biologie moléculaire de la cellule, Garland Publishing, N.Y., 1994, troisième édition, figure 10-7.

La bicouche lipidique confère aux membranes ses caractéristiques fluides. Le dessin suivant montre l'effet de la température sur le tassement des hydrocarbures. A noter qu'à basse température, la bicouche est à l'état de gel et bien tassée. À des températures (corporelles) plus élevées, la bicouche "fond" et l'intérieur est fluide, ce qui permet aux molécules lipidiques de se déplacer, de tourner, d'échanger des lieux. Cela permet également le mouvement d'autres composants de la membrane. La figure ci-dessous provient de Wolfe S.L., Biologie moléculaire et cellulaire, Wadsworth Publishing Company, 1993.

Cholestérol membranaire

Un autre type de lipide dans la membrane est le cholestérol. La quantité de cholestérol peut varier selon le type de membrane. Les membranes plasmiques contiennent près d'un cholestérol par molécule de phospholipide. D'autres membranes (comme celles qui entourent les bactéries) n'ont pas de cholestérol. La figure suivante montre la structure stéroïde du cholestérol. Les régions non polaires et polaires sont également illustrées en b) (Figure modifiée à partir de

Alberts et al. Biologie moléculaire de la cellule, Garland Publishing, N.Y., 1994, troisième édition, figure 10-8.

La molécule de cholestérol s'insère dans la membrane avec la même orientation que les molécules de phospholipide. Les figures montrent des molécules de phospholipides avec une molécule de cholestérol entre les deux. Notez que la tête polaire du cholestérol est alignée avec la tête polaire des phospholipides. Chiffre modifié de

Alberts et al. Biologie moléculaire de la cellule, Garland Publishing, N.Y., 1994, troisième édition, figure 10-9 ou

Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993 (figure ci-dessous).

Les molécules de cholestérol ont plusieurs fonctions dans la membrane :

  • Ils immobilisent les premiers groupes hydrocarbonés des molécules de phospholipides. Cela rend la bicouche lipidique moins déformable et diminue sa perméabilité aux petites molécules hydrosolubles. Sans cholestérol (comme dans une bactérie), une cellule aurait besoin d'une paroi cellulaire.
  • Le cholestérol empêche la cristallisation des hydrocarbures et les déphasages dans la membrane.

Glycolipides membranaires

Les glycolipides sont également un constituant des membranes. Sur cette figure, ils sont représentés par des groupes de sucre bleu se projetant dans l'espace extracellulaire. Ils peuvent micro-agréger dans la membrane. Ces composants de la membrane peuvent être protecteurs, isolants et sites de liaison au récepteur. Parmi les molécules liées par les glycososphingolipides, on peut citer les poisons cellulaires tels que les toxines cholériques et tétaniques. La figure du bas montre la structure chimique de deux exemples de glycososphingolipides.

Haut Figure modifiée d'Alberts et al. Biologie moléculaire de la cellule, Garland Publishing, N.Y., 1994, troisième édition, figure 10-11.

Formation de "Microdomaines"

Les sphingolipides et le cholestérol travaillent ensemble pour aider à regrouper les protéines dans une région appelée "microdomaine". Ils fonctionnent comme des "radeaux" ou des plates-formes pour la fixation des protéines lorsque les membranes sont déplacées autour de la cellule et également pendant la transduction du signal. Pour plus d'informations sur les radeaux et les « microdomaines », voir : Simons et Ikonen, Nature 387 : 569, 1997. Aussi, R.E. Brown, J. Cell Science 111 : 1-9, 1998

Protéines membranaires

En étudiant différents organites, vous découvrirez d'importantes protéines membranaires qui fonctionnent pour cet organite particulier.

Les protéines transmembranaires sont amphipathiques, en ce sens qu'elles possèdent des régions hydrophobes et hydrophiles qui sont orientées dans les mêmes régions de la bicouche lipidique. Un autre nom pour eux est "protéines intégrales". D'autres types de protéines peuvent être liées uniquement à la surface cytoplasmique (par fixation à une chaîne d'acide gras), ou à la surface cellulaire externe, fixées par un oligosaccharide. Ou bien, ces protéines non transmembranaires peuvent être liées à d'autres protéines membranaires. Collectivement, elles sont appelées "protéines membranaires périphériques".

Nous étudierons des protéines membranaires spécifiques dans des cours ultérieurs (canaux ioniques, protéines du réticulum endoplasmique, etc.). Par conséquent, cette présentation ne leur consacrera pas beaucoup de temps. Consultez les pages 486 et 487 de votre texte pour plus d'informations sur l'insertion d'une protéine transmembranaire. Les protéines insérées une fois à travers la membrane sont appelées "protéines transmembranaires à passage unique". Celles qui passent plusieurs fois sont appelées "protéines transmembranaires multipasses". Ils forment des boucles à l'extérieur de la membrane.


Mobilité des protéines membranaires

Les protéines membranaires et les phospholipides sont incapables d'aller et venir entre les feuillets interne et externe de la membrane à une vitesse appréciable. Cependant, parce qu'ils sont insérés dans une bicouche lipidique fluide, les protéines et les lipides sont capables de diffuser latéralement à travers la membrane. Ce mouvement latéral a été montré pour la première fois directement dans une expérience rapportée par Larry Frye et Michael Edidin en 1970, qui a fourni un support pour le modèle de la mosaïque fluide. Frye et Edidin ont fusionné des cellules humaines et de souris en culture pour produire des hybrides de cellules humaines-souris (Figure 12.11). Ils ont ensuite analysé la distribution des protéines dans les membranes de ces cellules hybrides à l'aide d'anticorps reconnaissant spécifiquement les protéines d'origine humaine et murine. Ces anticorps ont été marqués avec différents colorants fluorescents, de sorte que les protéines humaines et de souris ont pu être distinguées par microscopie à fluorescence. Immédiatement après la fusion, les protéines humaines et murines ont été localisées dans différentes moitiés des cellules hybrides. Cependant, après une brève période d'incubation à 37 ° C, les protéines humaines et murines étaient complètement mélangées à la surface cellulaire, indiquant qu'elles se déplaçaient librement à travers la membrane plasmique.

12.11

Mobilité des protéines membranaires. Des cellules humaines et de souris ont été fusionnées pour produire des cellules hybrides. La distribution des protéines de surface cellulaire a ensuite été analysée à l'aide d'anticorps anti-humains et anti-souris marqués avec différents colorants fluorescents (respectivement rouge et vert). (Suite. )

Cependant, toutes les protéines ne sont pas capables de diffuser librement à travers la membrane. Dans certains cas, la mobilité des protéines membranaires est restreinte par leur association avec le cytosquelette. Par exemple, une fraction de la bande 3 dans la membrane des globules rouges est immobilisée en raison de son association avec l'ankyrine et la spectrine. Dans d'autres cas, la mobilité des protéines membranaires peut être restreinte par leurs associations avec d'autres protéines membranaires, avec des protéines à la surface de cellules adjacentes, ou avec la matrice extracellulaire.

Contrairement aux cellules sanguines, les cellules épithéliales sont polarisées lorsqu'elles sont organisées en tissus, différentes parties de la cellule étant chargées de remplir des fonctions distinctes. Par conséquent, les membranes plasmiques de nombreuses cellules épithéliales sont divisées en apicale et des domaines baso-latéraux qui diffèrent par leur fonction et leur composition protéique (Figure 12.12). Par exemple, les cellules épithéliales de l'intestin grêle fonctionnent pour absorber les nutriments du tube digestif. La surface apicale de ces cellules, qui fait face à la lumière intestinale, est donc recouverte de microvillosités et spécialisées pour l'absorption des nutriments. La surface basolatérale, qui fait face au tissu conjonctif sous-jacent et à l'approvisionnement en sang, est spécialisée pour faciliter le transfert des nutriments absorbés dans la circulation. Afin de maintenir ces fonctions distinctes, la mobilité des protéines membranaires plasmiques doit être restreinte aux domaines appropriés de la surface cellulaire. Au moins une partie du mécanisme par lequel cela se produit implique la formation de jonctions serrées (qui sont discutées plus loin dans ce chapitre) entre les cellules adjacentes de l'épithélium. Ces jonctions non seulement scellent l'espace entre les cellules, mais servent également de barrières au mouvement des lipides et des protéines membranaires. En conséquence, les protéines sont capables de diffuser dans les domaines apical ou basolatéral de la membrane plasmique mais ne sont pas capables de passer d'un domaine à l'autre.

Graphique 12.12

Une cellule épithéliale intestinale polarisée. La surface apicale de la cellule contient des microvillosités et est spécialisée dans l'absorption des nutriments de la lumière intestinale. La surface basolatérale est spécialisée pour le transfert des nutriments absorbés vers le sous-jacent (suite. )


Radeaux lipidiques

Même au sein d'une seule cellule, la composition de la membrane plasmique diffère de celle des organites intracellulaires. Il existe même une hétérogénéité au sein d'une membrane elle-même - les lipides ne sont pas distribués de manière aléatoire dans la membrane. La recherche au cours des deux dernières décennies a identifié « radeaux » lipidiques qui semblent être spécifiques pour incorporer des protéines particulières. Puisqu'il s'agit de lipides non ancrés, les radeaux peuvent se déplacer latéralement à l'intérieur de la membrane, tout comme la plupart des molécules lipidiques individuelles. Enfin, il existe différents ratios de lipides entre les deux couches de la bicouche. La face cytoplasmique de chaque membrane aura des associations et des fonctions différentes de la face extracellulaire.

En termes généraux, les radeaux sont considérés comme de petites zones de lipides ordonnés à l'intérieur d'une membrane non dirigée plus grande. Les radeaux lipidiques se forment le plus souvent en association avec des protéines membranaires spécifiques en excluant d'autres. Habituellement, les protéines incluses ont des fonctions liées à la signalisation, et un modèle propose que ces protéines puissent diriger l'organisation de lipides sélectionnés autour d'elles plutôt que l'inverse.

Bien que certains phospholipides soient directement liés aux protéines et au cytosquelette, la plupart ne le sont pas. Ils sont donc libres de se déplacer dans le plan de sa couche de bicouche.

Le cholestérol est également abondamment présent dans les structures membranaires appelées radeaux lipidiques. Les radeaux lipidiques sont des structures organisées à l'intérieur de la membrane, contenant généralement des molécules de signalisation et d'autres protéines membranaires intégrales (Figure 6-15). Les radeaux lipidiques affectent la fluidité membranaire, la neurotransmission et le trafic des récepteurs et des protéines membranaires.

Figure 6-15 : Un radeau lipidique. 1 = Membrane non-radeau, 2 = Radeau lipidique, 3 = Protéine transmembranaire associée au radeau lipidique, 4 = Protéine membranaire non-radeau, 5 = Modifications de la glycosylation (sur les glycoprotéines et les glycolipides), 6 = Protéine ancrée GPI, 7 = Cholestérol , et 8 = glycolipide. Notez que le radeau lipidique est un groupe de différentes molécules (lipides et protéines) qui se déplacent comme une unité à travers la membrane. Notez que le côté du radeau pointant à l'extérieur de la cellule (emplacement B) a des composants nécessaires à sa fonction. Dans cet exemple, les phospholipides et les protéines glycosylés travailleront ensemble dans un but cellulaire spécifique.


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The structural role of cholesterol in cell membranes: from condensed bilayers to lipid rafts

CONSPECTUS: Defining the two-dimensional structure of cell membranes represents one of the most daunting challenges currently facing chemists, biochemists, and biophysicists. In particular, the time-averaged lateral organization of the lipids and proteins that make up these natural enclosures has yet to be established. As the classic Singer-Nicolson model of cell membranes has evolved over the past 40 years, special attention has focused on the structural role played by cholesterol, a key component that represents ca. 30% of the total lipids that are present. Despite extensive studies with model membranes, two fundamental issues have remained a mystery: (i) the mechanism by which cholesterol condenses low-melting lipids by uncoiling their acyl chains and (ii) the thermodynamics of the interaction between cholesterol and high- and low-melting lipids. The latter bears directly on one of the most popular notions in modern cell biology, that is, the lipid raft hypothesis, whereby cholesterol is thought to combine with high-melting lipids to form "lipid rafts" that float in a "sea" of low-melting lipids. In this Account, we first describe a chemical approach that we have developed in our laboratories that has allowed us to quantify the interactions between exchangeable mimics of cholesterol and low- and high-melting lipids in model membranes. In essence, this "nearest-neighbor recognition" (NNR) method involves the synthesis of dimeric forms of these lipids that contain a disulfide moiety as a linker. By means of thiolate-disulfide interchange reactions, equilibrium mixtures of dimers are then formed. These exchange reactions are initiated either by adding dithiothreitol to a liposomal dispersion to generate a small amount of thiol monomer or by including a small amount of thiol monomer in the liposomes at pH 5.0 and then raising the pH to 7.4. We then show how such NNR measurements have allowed us to distinguish between two very different mechanisms that have been proposed for cholesterol's condensing effect: (i) an umbrella mechanism in which the acyl chains and cholesterol become more tightly packed as cholesterol content increases because they share limited space under phospholipid headgroups and (ii) a template mechanism whereby cholesterol functions as a planar hydrophobic template at the membrane surface, thereby maximizing hydrophobic interactions and the hydrophobic effect. Specifically, our NNR experiments rule out the umbrella mechanism and provide strong support for the template mechanism. Similar NNR measurements have also allowed us to address the question of whether the interactions between low-melting kinked phospholipids and cholesterol can play a significant role in the formation of lipid rafts. Specifically, these NNR measurements have led to our discovery of a new physical principle in the lipids and membranes area that must be operating in biological membranes, that is, a "push-pull" mechanism, whereby cholesterol is pushed away from low-melting phospholipids and pulled toward high-melting lipids. Thus, to the extent that lipid rafts play a role in the functioning of cell membranes, low-melting phospholipids must be active participants.


Discussion

Plasma membranes (PMs) were isolated from trout using a combination of differential and density gradient centrifugation. The fraction obtained by this method has been previously characterized. It comprised 1.2–1.6% of the total cell protein, regardless of acclimation group. The apical domain marker 5′ nucleotidase was enriched by a factor of 11.14±2.03(20°C acclimated trout) and 10.96±1.51 (5°C trout) while the basolateral domain marker Na + /K + -ATPase was enriched by a factor of 38.64±9.26 (20°C trout) and 52.53±6.72 (5°C trout) (Hazel et al., 1992). Thus, both major domains of the PM are present and the preparation is reasonably representative of the cell membrane.

We used sonication and density gradient centrifugation to separate the PM into low and high buoyant density fractions. Liver from rainbow trout does not express the protein caveolin (Fig. 2A). Nevertheless, the low density fraction was enriched in molecules characteristic of lipid microdomains, including cholesterol(Fig. 3A Table 1) and both theβ 2 adrenergic receptor and adenylyl cyclase(Fig. 2B,C). These three molecules have been reported to be lipid microdomain enriched in other systems(Ostrom et al., 2001 Rybin et al., 2000 Xiang et al., 2002). Furthermore, the low density fraction was substantially depleted in the βsubunit of the insulin receptor, which is also consistent with previous observations (Mastick et al.,1995 Ohira et al.,2000). The even distribution of the protein clathrin among PM,RDPM and raft in our system is surprising since it is not associated with raft or caveolae microdomains (Razani and Lisanti, 2001). However, unlike all other proteins examined in this study, clathrin is not an integral membrane protein and can be separated from membranes by gentle dissociation(Keen et al., 1979). Therefore, it is possible that the sonication step used in separating the fractions acted to redistribute the protein among all membrane particles present in the preparation. Regardless, the weight of evidence suggests that this method separates trout liver PM into biochemically distinct fractions,including a low buoyant density fraction consistent with lipid microdomains. As this membrane fraction lacks caveolae, we will refer to it operationally as raft-enriched PM (raft) and the high buoyant fraction as raft-depleted PM(RDPM).

The discovery that the PM of most cells is not homogenous, but contains microdomains with distinct compositions, presents an opportunity for the re-examination of membrane thermal acclimation. In response to changing environmental temperatures, poikilotherms substantially alter the lipid composition of the PM (Hazel,1997). Many studies have sought to rationalize these compositional changes as mechanisms of homeostasis for specific physical properties, notably hydrophobic region fluidity/order (homeoviscous adaptation), with the implication that critical functions are sensitive to these properties(Hazel, 1997). However, these studies have examined the PM as a whole. It is possible that the compositions of different regions of the PM are altered in different ways during thermal acclimation. Furthermore, microdomains form as a result of a separation of liquid-ordered (Lo raft) and liquid-disordered (LRDPM) phases within the membrane (Ahmed et al., 1997). Since lipid phase behavior is temperature sensitive,it is reasonable to hypothesize that acute changes in temperature could disrupt raft structure and the function of raft-targeted proteins. Consequently, acclimatory compositional changes of the PM may be aimed at stabilizing raft structure against thermal perturbation. Therefore, we sought to determine what general compositional changes occur in raft and RDPM portions of the PM during thermal acclimation. We measured the cholesterol,phospholipid and total protein content of raft, RDPM and total PM of livers from cold- and warm-acclimated trout.

Rafts from both acclimation groups are substantially depleted in total protein compared with PM or RDPM (Table 1). The protein is primarily replaced by an enrichment in phospholipids in the cold-acclimated raft (although cholesterol is also enriched). By contrast, cholesterol accounts for most of the lipid enrichment in warm-acclimated rafts (Fig. 3A,B Table 1). As a result, the cholesterol/phospholipid (Ch/PL) ratio is highly elevated in warm-acclimated raft while the Ch/PL is not changed in cold-acclimated raft compared with its PM source (Fig. 3B). The Ch/PL ratio is probably the most important measure for raft stabilization since it is an interaction between cholesterol and specific lipids, and not cholesterol concentration en soi, that favors raft formation. This suggests that there are important differences in how rafts are stabilized in cold- and warm-acclimated animals. The data also demonstrate that the increase in cholesterol concentration is larger in raft than in RDPM with acclimation to 20°C (Table 1). Collectively, these data suggest that the compositional changes associated with thermal acclimation are at least partially related to properties specific to raft membrane.

If thermal acclimatory compositional adjustments can be explained in terms of raft stabilization, we would expect that molecular interaction strength(and thus the tendency to form the Lo phase) would be regulated in rafts to offset thermal perturbation. Membrane solubilization by detergent has previously been used to measure this property(Ahmed et al., 1997), but most analyses have failed to appreciate or account for the different stages of detergent–membrane interaction. Detergent molecules added to a membrane suspension are initially incorporated into the bilayer structure, suppressing the free detergent monomer concentration below the critical micelle concentration (CMC Fig. 1A,plates 1, 2). As the membrane saturates, detergent monomer concentration in solution exceeds the CMC, mixed micelles form and the membrane begins to be solubilized (Fig. 1A, plates 3,4) (Lichtenberg et al., 1983). The capacity of a membrane to incorporate detergent monomers is inversely proportional to the lipid–lipid interaction strength in the membrane(Lichtenberg et al., 1979). For example, a Langmuir trough study demonstrated that small increases in lateral pressure, with concomitant increases in lipid cohesion forces,resulted in large decreases in the incorporation of Triton X-100(Nyholm and Slotte, 2001).

We found this interpretation to be well supported in model vesicle studies. The membrane condensing effect of an addition of 30 mol% cholesterol to palmitoyloleoyl phosphatidylcholine (POPC) vesicles was easily detected as a dramatic reduction in the SP (Fig. 4B). Furthermore, myristoylpalmitoyl phosphatidylcholine (MPPC)vesicles saturated with less detergent in the tightly packed gel phase than in the fluid phase (Fig. 4A). Similar results have previously been reported for sphingomyelin vesicles(Patra et al., 1999). A reduction in SP was observed with an increase in temperature up to, but remaining below, the acyl chain melting temperature in MPPC vesicles(Fig. 4A), sphingomyelin vesicles (Patra et al., 1999)and biological membranes (Fig. 7B). Prior to the dramatic decreases in packing density associated with a phase transition, increases in temperature within a phase cause increased membrane lateral pressure (de Kruijff, 1997). This may explain the lowered SP observed in these cases.

Membrane molecular interaction strength also influences the detergent/lipid values necessary to disrupt bilayer morphology and incorporate membrane molecules into mixed micelles (solubilization slopes). For example, a relatively high concentration of detergent was required to fully dissolve the vesicles made of POPC and 30 mol% cholesterol, producing a shallow solubilization slope (Fig. 5B). As predicted, the solubilization slope produced during dissolution of the more loosely packed POPC vesicles was comparatively steep. However, this measure tends to be less informative than SPs since this process is much more sensitive to variables other than molecular interaction strength. For example,the CMC of Triton X-100 is temperature sensitive(Elworthy et al., 1968a) and,contrary to prediction, the solubilization slopes for MPPC vesicles are much steeper in the gel phase compared with the fluid phase(Fig. 5A). Furthermore, the ability of detergent micelles to incorporate lipids, a property known as maximum additive concentration, is strongly dependent on the molecular species to be solubilized (Elworthy et al.,1968b). This complicates the interpretation of these data collected on biochemically distinct fractions.

Nevertheless, differences in solubilization slope between raft and RDPM are probably responsible for the detergent resistance of rafts, which is widely observed and commonly used in their isolation. The most commonly used detergent-based raft isolation method exposes isolated PM to Triton X-100 at 4°C and floats the remaining undissolved raft-enriched membrane on a sucrose density gradient (Brown and Rose,1992). In the current study, raft membranes produced lower normalized optical densities than either PM or RDPM at most detergent concentrations (Fig. 6). This reflects the large differences in the SPs of these membranes but seems contradictory to the use of detergent as a means of raft isolation since it suggests that raft would dissolve more readily than RDPM. However, this is easily resolved when considering the solubilization process of PM as a mixture of raft and RDPM membranes. The PM sample as a whole would become saturated with detergent before the process of solubilization became dominant. This would effectively remove the differences in SPs between raft and RDPM membranes, and the solubilization process would be primarily defined by the process measured by the solubilization slopes of the RDPM and raft. The RDPM fractions had steeper solubilization slopes than the raft or PM in both acclimation groups (Fig. 10). Therefore, RDPM membrane would be more rapidly solubilized, leaving a raft-enriched fraction behind.

The difference in packing strength between raft and RDPM indicated by the solubilization slopes is also evident in the SP data(Fig. 7A). The more shallow solubilization slope and lower SP of raft, compared wiht RDPM, probably reflects the Lo phase of this microdomain. Proteins can be targeted to the Lo phase rafts by modification with saturated lipids that are more soluble in the tightly packed Lo than in the Lphase (Melkonian et al.,1999). Since the SP (and packing strength) of membrane in either phase is acutely temperature sensitive(Fig. 7B), it is possible that perturbations of this property could influence the targeting of proteins to rafts. Furthermore, differences in packing strength may have functional consequences for the proteins embedded in the membrane. Integral membrane proteins may require a specific range of lateral pressure to allow appropriate flexing without allowing the protein to relax into non-functional conformations (de Kruijff,1997). Finally, a sufficiently large increase in temperature could drive a phase transition, effectively melting Lo phase raft and resulting in mixing with the RDPM membrane. Conversely, a large decrease in temperature could result in accretion of lipids and proteins normally excluded from rafts.

Therefore, we examined the fractions from both acclimation groups at both assay temperatures to determine if membrane packing strength was conserved during thermal acclimation (Fig. 8). In both the PM and RDPM, samples assayed at a common temperature gave similar SPs. As a result, the warm-acclimated samples assayed at 20°C were different from the cold-acclimated samples assayed at 5°C(physiological comparisons Fig. 8, dots). However, this perturbation was not seen in the raft membranes. The SPs of the warm-acclimated rafts were substantially up-shifted with respect to the cold-acclimated rafts such that there was little difference in this property when examined at physiological temperatures. To our knowledge, this is the first evidence of an apparent regulation of a physical property of a subdomain of the PM. Such regulation would be expected to maintain raft structural integrity and packing properties despite differing thermal environments experienced by the organism.

An increase of assay temperature above the gel–fluid phase transition was detected as a dramatic increase in SP for the MPPC vesicles(Fig. 4). Our observation that an increase in assay temperature from 5°C to 20°C resulted in an augmenter in SP in one raft sample from cold-acclimated fish suggested that rafts from these animals were close to their Lo–L melting temperature at 20°C. To test this hypothesis, all samples were assayed at 28°C(Fig. 9). Since RDPM is in the L phase, an increase in temperature should not cause an increase in SP. Indeed, there were only small and non-significant SP increases in RDPM from both acclimation groups. By contrast, the SP of the raft samples assayed at 28°C was significantly greater than those measured at 20°C in both acclimation groups. The dramatic increase in SP at 28°C suggests that the raft membranes from both acclimation groups were above their Lo–L melting temperature at this temperature. In the plasma membrane, clustered raft proteins and lipids would be expected to mix randomly with RDPM molecules under these conditions.

In conclusion, there is apparent spatial heterogeneity in the response of the PM to thermal change. Compositional changes associated with thermal acclimation are different in the raft and RDPM portions of the PM. Specifically, the ratio of cholesterol to phospholipid is elevated in rafts from warm-acclimated, but not from cold-acclimated, animals compared with their PM sources. Furthermore, there is a conservation of membrane packing strength in the raft, but not the raft-depleted, regions of the PM. This is consistent with a regulation of this physical property, which may have functional consequences for phase-dependent protein targeting. Furthermore,the detergent data suggest that elevated temperature can abolish the Lo/L phase separation responsible for raft structure. The raft-associated compositional changes observed may also function to stabilize these microdomains.


Voir la vidéo: Microdomaine lipidique, Raft, radeau lipidique (Février 2023).