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Problèmes d'interprétation de la lame de coloration de Gram

Problèmes d'interprétation de la lame de coloration de Gram


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Ma question principale est la suivante : lorsque vous interprétez les résultats de la coloration de Gram, la couleur majoritaire détermine-t-elle si elle est positive ou négative ?

On nous a donné des inconnues et nous devons maintenant déterminer ce qu'est l'organisme. J'ai du mal à interpréter les résultats de la coloration de Gram. En ce qui concerne la morphologie, ils sont tous des cocci et (en quelque sorte) en grappes mais (c'est la partie déroutante) ils sont à la fois violets et roses. Je comprends que le violet indique gram+ et le rose est gram-, mais il devrait y avoir un genre d'organisme et non deux. Alors, ne devrait-il pas y avoir que du violet ou que du rose, mais pas les deux ? Dois-je rechercher la couleur "majoritaire" et l'utiliser pour décider si j'ai pos ou neg ? Autrement dit, si c'est principalement violet, cela signifie-t-il pos,… mais si oui, alors pourquoi y a-t-il encore des coques roses sur la diapositive ?

Je comprends aussi pourquoi les gram-pos apparaissent violets, --que le complexe cristal violet-iode est retenu en raison des parois cellulaires plus épaisses des gram-pos… et des parois cellulaires plus fines des gram-nég, elles sont donc décolorées et apparaissent de la couleur du contre-tache.

De plus, je n'ai certainement pas vu de tiges dans mon toboggan, juste des cocci.


La seule raison pour laquelle il montre les deux couleurs est due à une manipulation imparfaite lors de la coloration. Vous ne pouvez pas compter sur la majorité pour déterminer le résultat de la tache.

Dans votre cas précis, le rinçage ou la décoloration à l'EtoH n'a probablement pas été suffisamment effectué et la safrainine n'a pas été totalement éliminée.

Le meilleur moyen d'être sûr du résultat serait de refaire la coloration.

Un bon conseil lors de la coloration est d'avoir des doubles ou des triples.

Deuxièmement, pour répondre à ce que vous avez dit ici :

Je comprends aussi pourquoi les gram-pos apparaissent violets, --que le complexe cristal violet-iode est retenu en raison des parois cellulaires plus épaisses des gram-pos… et des parois cellulaires plus fines des gram-nég, elles sont donc décolorées et apparaissent de la couleur du contre-tache.

En fait ce n'est pas seulement l'épaisseur de la paroi cellulaire qui va faire que les bactéries retiennent ou non le cristal violet. Les bactéries à Gram positif ont une membrane plasmique puis le peptidoglycane sur le dessus tandis que les bactéries à Gram négatif ont une membrane plasmique, puis le peptidoglycane et une autre membrane externe sur le dessus. Le cristal violet "colle" principalement au peptidoglycane.

La décoloration enlèvera la tache sur la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Vous aviez raison avec le fait que les bactéries Gram positives auront un peptidoglycane plus épais.

Gram + vs Gram - parois cellulaires http://www.diffen.com/difference/Gram-negative_Bacteria_vs_Gram-positive_Bacteria


Interprétation des colorations de Gram et d'autres préparations de lames microbiologiques courantes

Cet Atlas a été rédigé pour aider les cliniciens, les microbiologistes et le personnel de laboratoire à identifier les organismes dans les matériaux infectés colorés par des techniques couramment utilisées dans la plupart des laboratoires cliniques. En raison de sa valeur séculaire en tant qu'outil d'enseignement pour les laboratoires cliniques et les médecins, la plus grande partie possible du format imprimé original d'Atlas&apos a été conservée pour cette version électronique, avec quelques révisions dans la nomenclature des organismes.

Étant donné que les microbes cultivés sur les milieux de culture peuvent sembler différents de ceux des échantillons cliniques d'origine, seules les colorations des échantillons cliniques sont incluses. Vous trouverez ci-dessous une brève description des colorations utilisées et des techniques microscopiques, suivie de liens vers des sections d'images et des descriptions des agents pathogènes récupérés dans les sources corporelles suivantes : crachats urine sécrétions vaginales, cervicales et urétrales peau abcès intra-abdominaux liquide céphalo-rachidien et tissus divers.

La suspicion qu'un patient a une infection découle de l'interprétation par le clinicien de l'anamnèse, de l'examen physique, de certains résultats de tests de laboratoire et, parfois, des procédures radiographiques. Le diagnostic définitif dépend généralement de l'isolement des agents pathogènes sur des milieux de culture appropriés. Cependant, de nombreux patients nécessitent un traitement rapide avant que les résultats de la culture soient disponibles. Fréquemment, l'identification présomptive des agents pathogènes peut être faite à partir d'un examen microscopique du matériel infecté (par exemple, crachats, pus, urine, liquide céphalo-rachidien), et le traitement peut être choisi en toute confiance et de manière rationnelle. Étant donné que les bactéries causent tant d'infections graves pouvant être traitées, cette collection se concentre sur la coloration de Gram, la technique de coloration la plus importante pour identifier les bactéries en utilisant la microscopie optique. Cependant, plusieurs autres préparations de lames microbiologiques sont également discutées et illustrées.

Sauf indication contraire, chaque micrographie a été prise à travers une lentille à immersion dans l'huile (100x) (grossissement total de 1 000x).

  • la présence d'un seul type ou de plusieurs types d'organismes
  • le type d'organisme prédominant s'il y en a plus d'un
  • les caractéristiques de coloration (gram positif ou gram négatif)
  • la forme des organismes, bâtonnets (bacilles) ou ronds (cocci)
  • la taille des organismes : petit, grand, mince, dodu
  • la configuration : organismes isolés, paires, chaînes, touffes, grappes, ramification
  • la relation avec les cellules inflammatoires car certains organismes sont typiquement à l'intérieur des cellules inflammatoires (intracellulaires) ou y adhèrent

Examen des taches de Gram des expectorations

Examen des taches de Gram d'urine (6 images)

Examen des taches de Gram des sécrétions vaginales (6 images)

Examen des taches de Gram des écoulements cervicaux et urétraux (3 images)


Hématoxyline et éosine (H & E) : coloration de routine

Il s'agit de la coloration histologique la plus courante, utilisée pour différencier différentes structures tissulaires. Elle joue également un rôle important dans le diagnostic de diverses pathologies. Hématoxyline, est un colorant naturel que l'on trouve dans le bois des arbres Longwood en Amérique centrale. Dans la coloration H&E, un mélange d'hématoxyline oxydée connue sous le nom de hématine est utilisé. En raison de la faible affinité de l'hématine avec les tissus, un mordant est incorporé dans le colorant H&E. Les mordants les plus couramment utilisés sont les sels d'aluminium, de fer et de tungstène. Cette substance est connue sous le nom hémalum. Lorsqu'il est appliqué sur une coupe de tissu, l'hémalum colore les noyaux en bleu. L'échantillon est ensuite contre-coloré à l'aide d'une solution de éosine (soit de l'alcool, soit de l'eau), qui colore les protéines et le cytoplasme de différentes nuances de rose. Les éosines sont des colorants xanthènes et ont différents types, mais généralement, l'éosine Y est couramment utilisée.

Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine du tissu conjonctif lâche (lame histologique)

La procédure générale de la coloration H & E est la suivante :

  • La coupe est réhydratée puis nettoyée à l'aide xylène
  • Il est ensuite immergé dans hématoxyline, la durée de la tache varie selon le type, l'âge de la tache et les préférences personnelles.
  • Ici, il y a 2 options potentielles - progressive ou régressive. Régressif implique de trop colorer la section, puis de rincer l'excès. Progressive implique d'utiliser un colorant moins concentré et de le vérifier à intervalles jusqu'à ce que la section soit suffisamment colorée
  • La coupe est rincée au robinet l'eau puis immergé dans un solution acide-alcoolique
  • Il est immergé dans le robinet l'eau
  • La section est plongée dans éosine tache
  • L'excès de tache est rincé au robinet l'eau
  • La coupe est déshydratée avec éthanol, et monté à l'aide d'un résineuxmoyen

Procédure de coloration de Gram

Les médecins veulent souvent déterminer quel type de bactérie est présent chez un patient qui a une infection. Par conséquent, les professionnels doivent effectuer plusieurs tests, et l'un de ces tests est la procédure de coloration de Gram. Les experts utilisent la procédure de coloration de Gram comme l'une des techniques pour différencier 2 groupes de bactéries en fonction de leurs caractéristiques de paroi cellulaire. Cela implique l'utilisation d'un colorant pour voir quelles bactéries conservent la couleur et le violet ou le rouge dans leurs parois cellulaires.

Quand appliquer la coloration de Gram

  • La procédure de coloration de Gram est utilisée pour déterminer si les bactéries sont gram-positives ou gram-négatives. Il s'agit généralement de la première étape du processus d'identification des bactéries présentes dans les cultures.
  • Cette procédure est importante pour donner un indice au diagnostic chez les personnes atteintes de maladies infectieuses. Il aide également à estimer le nombre total de bactéries.
  • Les médecins peuvent faire un choix empirique sur le type d'antibiotiques qu'ils peuvent prescrire à un patient, sur la base des résultats de la procédure de coloration de Gram.
  • Le choix d'un milieu de culture à utiliser pour l'inoculation peut également être fait empiriquement sur la base du rapport de coloration de Gram.

Comment se déroule la procédure de coloration de Gram ?

1. Préparer la lame microscopique en verre

Pour vous assurer que vos lames sont exemptes de graisse/huile, vous devez d'abord les laver avec de l'eau et du savon, puis essuyer les lames avec de l'alcool. Cela enlèvera toute trace de doigt ou de saleté. Séchez les lames et placez-les sur des serviettes de laboratoire jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être utilisées.

2. Étiquetez les diapositives

Tracez un cercle sous les lames à l'aide d'un marqueur conçu pour la verrerie. Cela aidera à désigner la zone pour préparer le frottis à l'étape suivante. Vous pouvez également les étiqueter avec les initiales de l'organisme au bord de chaque diapositive. Veiller à ce que les étiquettes n'entrent pas en contact avec les réactifs utilisés pour la coloration.

3. Préparez le frottis

Pour faire une suspension bactérienne dans un bouillon, utilisez une anse stérile refroidie pour placer une petite quantité de bouillon de culture sur votre lame. En effectuant un mouvement circulaire, étalez le bouillon avec l'anse d'ensemencement jusqu'à ce qu'il fasse environ 1 cm de diamètre. Ne pas étaler excessivement pour éviter de perturber l'arrangement cellulaire. Un frottis approprié permet d'examiner les cellules isolées et leur disposition cellulaire caractéristique.

Pour faire une culture sur plaque bactérienne, utilisez une anse stérile refroidie et placez une goutte de solution saline ou d'eau stérile sur une lame. Après avoir restérilisé et refroidi la boucle, prélevez un petit échantillon de colonie bactérienne. Remuez doucement la colonie dans l'eau ou la solution saline sur la lame et faites une émulsion.

Pour les échantillons sur écouvillon, roulez un écouvillon sur une lame de verre propre

Noter: Évitez de préparer un frottis épais et dense avec un excès d'échantillon bactérien. Cela empêchera la lumière de passer et rendra difficile la vision de la morphologie cellulaire. Les frottis ne nécessitent généralement que de petites quantités de culture bactérienne. Un frottis idéal consiste en un film mince blanchâtre après le processus de thermofixation.

4. Fixation à chaud

Cette étape tue les bactéries sur le frottis et les fait adhérer fermement à la lame, permettant à l'échantillon d'absorber les taches plus facilement. Séchez votre frottis à l'air. Tout en tenant votre lame à une extrémité (côté frottis vers le haut), passez la lame à travers la flamme d'un bec Bunsen, 2-3 fois. Éviter la surchauffe pour éviter la coagulation et la distorsion des protéines dans l'échantillon. Vous êtes maintenant prêt pour la procédure de coloration de Gram.

5. Coloration de Gram

  • Placer le frottis thermofixé sur un plateau de coloration.
  • Inondez doucement votre frottis avec du cristal violet. Laissez reposer une minute.
  • Inclinez légèrement la glissière et rincez doucement avec de l'eau du robinet ou de l'eau distillée à l'aide d'une pissette.
  • Maintenant, inondez doucement le frottis avec de l'iode de Gram. Laissez reposer une minute.
  • Inclinez légèrement la glissière et rincez doucement avec de l'eau du robinet ou de l'eau distillée provenant d'une pissette. Maintenant, votre frottis apparaîtra en violet sur votre diapositive.
  • À l'aide d'acétone ou d'alcool éthylique à 95 %, décolorer le frottis. Inclinez légèrement la lame et appliquez de l'alcool par gouttes pendant 5 à 10 secondes jusqu'à ce que le liquide soit clair. Ne pas trop décolorer.
  • Rincer immédiatement à l'eau.
  • Contre-coloration en inondant doucement le frottis avec de la safranine. Laisser reposer environ 45 secondes.
  • Inclinez légèrement la lame et rincez doucement avec de l'eau du robinet ou de l'eau distillée provenant d'une pissette.
  • Épongez-le avec du papier absorbant.
  • Examiner le frottis au microscope optique (immersion dans l'huile).

Voici une vidéo illustrant comment effectuer la procédure de coloration de Gram en détail :

Quels résultats la procédure de coloration de Gram révèle-t-elle ?

La procédure de coloration de Gram permet de distinguer les bactéries avec des parois cellulaires plus épaisses de celles avec des parois cellulaires plus minces, en raison de la quantité de peptidoglycane dans leurs parois. Les cellules aux parois plus minces ont plus d'une couche de lipopolysaccharides que les peptidoglycanes dans leurs parois.

Le cristal violet et l'iode pénètrent dans les deux types de parois cellulaires bactériennes et se combinent pour devenir des molécules plus grosses à l'intérieur de ces parois. Cependant, lorsqu'elles sont lavées à l'alcool, les bactéries aux parois cellulaires plus épaisses contenant des peptidoglycanes ont tendance à retenir ces molécules et à rester de couleur violette, elles sont donc appelées bactéries à Gram positif. D'un autre côté, le colorant est lavé des bactéries avec des parois cellulaires plus minces, et celles-ci sont considérées comme gram-négatives. Ces derniers ne deviennent pas incolores, mais roses lorsqu'ils sont contre-colorés à la safranine.


1. Biosolutions : animation Western Blot

« Le western blot (ou immunoblot) est une méthode de détection de protéines spécifiques dans un échantillon donné d'homogénat ou d'extrait de tissu. Il utilise l'électrophorèse sur gel pour séparer les protéines natives ou dénaturées par la longueur du polypeptide (conditions dénaturantes) ou par la structure 3-D de la protéine (conditions natives/non dénaturantes). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane (typiquement de la nitrocellulose ou du PVDF), où elles sont sondées (détectées) à l'aide d'anticorps spécifiques de la protéine cible. Il existe maintenant de nombreuses sociétés de réactifs spécialisées dans la fourniture d'anticorps (à la fois monoclonaux et polyclonaux) contre plusieurs milliers de protéines différentes. Les anticorps commerciaux peuvent être coûteux, bien que l'anticorps non lié puisse être réutilisé entre les expériences. Cette méthode est utilisée dans les domaines de la biologie moléculaire, de la biochimie, de l'immunogénétique et d'autres disciplines de la biologie moléculaire. D'autres techniques apparentées comprennent l'utilisation d'anticorps pour détecter des protéines dans les tissus et les cellules par immunocoloration et dosage immuno-enzymatique (ELISA). La méthode provient du laboratoire de George Stark à Stanford. Le nom western blot a été donné à la technique par W. Neal Burnette et est un jeu sur le nom Southern blot, une technique de détection d'ADN développée précédemment par Edwin Southern. La détection de l'ARN est appelée Northern blot. (Biosolutions – vidéo) Texte : Consultez le document suivant pour lire une description des étapes impliquées dans un Western Blot de Biosolutions.
Description de la procédure: Western Blot

2. WH Freeman Animation : Western Blot (Immunobuvardage)

Vous pouvez afficher les didacticiels animés dans une version diapositive par diapositive au fur et à mesure que vous naviguez ou dans une version commentée qui navigue pour vous.


Centre de diagnostic en santé animale

Cette technique est utilisée pour colorer une lame telle qu'un frottis fécal pour observer la microflore bactérienne présente en fonction de leur réaction de coloration de Gram.

  • "Fixer à la chaleur" la lame avec le spécimen en le passant sur une source de chaleur, telle qu'une flamme, plusieurs fois à l'aide d'une pince à linge ou d'une pince. La lame doit passer très rapidement à travers la flamme et ne pas être chauffée excessivement. Placer la lame sur le plateau de coloration.
  • Inonder le frottis fixé avec une solution de cristal violet (#1) et laisser reposer pendant 1 minute.
  • Rincez le cristal violet avec de l'eau distillée ou du robinet.
  • Inonder la lame avec une solution d'iode (#2). Laisser reposer une minute.
  • Rincer la solution d'iode avec de l'eau distillée ou du robinet.
  • En tenant la lame inclinée avec une épingle à linge, inondez la lame de décolorant (n° 3) pendant une à cinq secondes.
  • Rincez le décolorant avec de l'eau distillée ou du robinet.
  • Inonder la lame de safranine (#4). Laisser reposer 30 secondes.
  • Rincer la safranine avec de l'eau distillée ou du robinet.
  • Sécher la lame sur du papier absorbant ou du papier absorbant et la placer en position verticale.

Examiner au microscope la lame pour les organismes bactériens sous un objectif 100X. Observez plusieurs champs sur la lame pour les organismes bactériens. Décrivez la réaction de Gram de tous les organismes observés. Les bactéries Gram-positives se colorent du violet foncé au bleu et les bactéries Gram-négatives se colorent du rose au rouge. Si votre diapositive est d'une seule couleur (rose ou bleu), alors la diapositive peut avoir été sur ou sous décolorée. À moins qu'il ne s'agisse d'une coloration de Gram d'une culture pure, il devrait normalement y avoir du matériel colorant les deux couleurs quelque part sur la lame.


2.4 Coloration des échantillons microscopiques

À l'état naturel, la plupart des cellules et des micro-organismes que nous observons au microscope manquent de couleur et de contraste. Cela rend difficile, voire impossible, de détecter des structures cellulaires importantes et leurs caractéristiques distinctives sans traiter artificiellement les spécimens. Nous avons déjà fait allusion à certaines techniques impliquant des taches et des colorants fluorescents, et dans cette section, nous discuterons plus en détail des techniques spécifiques pour la préparation des échantillons. En effet, de nombreuses méthodes ont été développées pour identifier des microbes spécifiques, des structures cellulaires, des séquences d'ADN ou des indicateurs d'infection dans des échantillons de tissus, au microscope. Ici, nous nous concentrerons sur les techniques les plus pertinentes sur le plan clinique.

Préparation des échantillons pour la microscopie optique

En milieu clinique, les microscopes optiques sont les microscopes les plus couramment utilisés. Il existe deux types de préparation de base utilisés pour visualiser les spécimens avec un microscope optique : les montages humides et les spécimens fixes.

Le type de préparation le plus simple est le montage humide, dans lequel l'échantillon est placé sur la lame dans une goutte de liquide. Certains spécimens, comme une goutte d'urine, sont déjà sous forme liquide et peuvent être déposés sur la lame à l'aide d'un compte-gouttes. Des échantillons solides, tels qu'un grattage cutané, peuvent être placés sur la lame avant d'ajouter une goutte de liquide pour préparer le montage humide. Parfois, le liquide utilisé est simplement de l'eau, mais souvent des taches sont ajoutées pour améliorer le contraste. Une fois le liquide ajouté à la lame, une lamelle est placée sur le dessus et l'échantillon est prêt à être examiné au microscope.

La deuxième méthode de préparation des échantillons pour la microscopie optique est la fixation. La « fixation » d'un échantillon fait référence au processus de fixation des cellules sur une lame. La fixation est souvent réalisée soit par chauffage (fixation thermique) soit par traitement chimique de l'échantillon. En plus de fixer l'échantillon à la lame, la fixation tue également les micro-organismes dans l'échantillon, arrêtant leur mouvement et leur métabolisme tout en préservant l'intégrité de leurs composants cellulaires pour l'observation.

Pour fixer un échantillon à la chaleur, une fine couche de l'échantillon est étalée sur la lame (appelée frottis ), et la lame est ensuite brièvement chauffée sur une source de chaleur (Figure 2.31). Les fixateurs chimiques sont souvent préférables à la chaleur pour les échantillons de tissus. Les agents chimiques tels que l'acide acétique, l'éthanol, le méthanol, le formaldéhyde (formol) et le glutaraldéhyde peuvent dénaturer les protéines, arrêter les réactions biochimiques et stabiliser les structures cellulaires dans les échantillons de tissus (figure 2.31).

En plus de la fixation, la coloration est presque toujours appliquée pour colorer certaines caractéristiques d'un spécimen avant de l'examiner au microscope optique. Les taches, ou colorants, contiennent des sels constitués d'un ion positif et d'un ion négatif. Selon le type de colorant, l'ion positif ou négatif peut être le chromophore (l'ion coloré) l'autre, l'ion non coloré est appelé le contre-ion. Si le chromophore est l'ion chargé positivement, le colorant est classé comme colorant basique si l'ion négatif est le chromophore, le colorant est considéré comme un colorant acide.

Les colorants sont sélectionnés pour la coloration en fonction des propriétés chimiques du colorant et de l'échantillon observé, qui déterminent comment le colorant interagira avec l'échantillon. Dans la plupart des cas, il est préférable d'utiliser un colorant positif, un colorant qui sera absorbé par les cellules ou les organismes observés, en ajoutant de la couleur aux objets d'intérêt pour les faire ressortir sur le fond. Cependant, il existe des scénarios dans lesquels il est avantageux d'utiliser un colorant négatif, qui est absorbé par le fond mais pas par les cellules ou les organismes de l'échantillon. La coloration négative produit un contour ou une silhouette des organismes sur un fond coloré (Figure 2.32).

Parce que les cellules ont généralement des parois cellulaires chargées négativement, les chromophores positifs dans les colorants basiques ont tendance à coller aux parois cellulaires, ce qui en fait des taches positives. Ainsi, les colorants basiques couramment utilisés tels que la fuchsine basique, le violet cristal, le vert malachite, le bleu de méthylène et la safranine servent généralement de colorants positifs. D'autre part, les chromophores chargés négativement dans les colorants acides sont repoussés par les parois cellulaires chargées négativement, ce qui en fait des taches négatives. Les colorants acides couramment utilisés comprennent la fuchsine acide, l'éosine et le rose bengale. La figure 2.40 fournit plus de détails.

Certaines techniques de coloration impliquent l'application d'un seul colorant à l'échantillon, d'autres nécessitent plus d'un colorant. Dans la coloration simple, un seul colorant est utilisé pour souligner des structures particulières dans l'échantillon. Une simple coloration fera généralement apparaître tous les organismes d'un échantillon de la même couleur, même si l'échantillon contient plus d'un type d'organisme. En revanche, la coloration différentielle distingue les organismes en fonction de leurs interactions avec plusieurs colorations. En d'autres termes, deux organismes dans un échantillon coloré différemment peuvent sembler être de couleurs différentes. Les techniques de coloration différentielle couramment utilisées en milieu clinique comprennent la coloration de Gram, la coloration acido-résistante, la coloration des endospores, la coloration des flagelles et la coloration des capsules. La figure 2.41 fournit plus de détails sur ces techniques de coloration différentielle.

Vérifie ta compréhension

  • Expliquez pourquoi il est important de fixer un spécimen avant de le regarder au microscope optique.
  • Quels types d'échantillons doivent être fixés chimiquement plutôt que thermofixés ?
  • Pourquoi un colorant acide pourrait-il réagir différemment avec un échantillon donné qu'un colorant basique ?
  • Expliquez la différence entre une coloration positive et une coloration négative.
  • Expliquez la différence entre la coloration simple et différentielle.

Coloration de Gram

La procédure de coloration de Gram est une procédure de coloration différentielle qui implique plusieurs étapes. Elle a été développée par le microbiologiste danois Hans Christian Gram en 1884 comme une méthode efficace pour distinguer les bactéries avec différents types de parois cellulaires, et même aujourd'hui, elle reste l'une des techniques de coloration les plus fréquemment utilisées. Les étapes de la procédure de coloration de Gram sont répertoriées ci-dessous et illustrées à la figure 2.33.

  1. Tout d'abord, du cristal violet, un colorant primaire, est appliqué sur un frottis thermofixé, donnant à toutes les cellules une couleur violette.
  2. Ensuite, l'iode de Gram, un mordant, est ajouté. Un mordant est une substance utilisée pour fixer ou stabiliser les taches ou les colorants dans ce cas, l'iode de Gram agit comme un agent de piégeage qui se complexe avec le cristal violet, faisant s'agglomérer le complexe cristal violet-iode et rester contenu dans d'épaisses couches de peptidoglycane dans la cellule des murs.
  3. Ensuite, un agent décolorant est ajouté, généralement de l'éthanol ou une solution acétone/éthanol. Les cellules qui ont des couches épaisses de peptidoglycane dans leurs parois cellulaires sont beaucoup moins affectées par l'agent décolorant, elles retiennent généralement le colorant cristal violet et restent violets. Cependant, l'agent décolorant élimine plus facilement le colorant des cellules avec des couches de peptidoglycane plus minces, les rendant à nouveau incolores.
  4. Enfin, une contre-coloration secondaire, généralement de la safranine, est ajoutée. Cela colore les cellules décolorées en rose et est moins visible dans les cellules qui contiennent encore le colorant cristal violet.

Les cellules colorées en violet cristal-violet sont appelées cellules gram-positives, tandis que les cellules rouges colorées en safranine sont gram-négatives (figure 2.34). Cependant, il y a plusieurs considérations importantes dans l'interprétation des résultats d'une coloration de Gram. Premièrement, les cellules bactériennes plus âgées peuvent avoir des dommages à leurs parois cellulaires qui les font apparaître gram-négatives même si l'espèce est gram-positive. Ainsi, il est préférable d'utiliser des cultures bactériennes fraîches pour la coloration de Gram. Deuxièmement, des erreurs telles que laisser trop longtemps le décolorant peuvent affecter les résultats. Dans certains cas, la plupart des cellules apparaîtront gram-positives tandis que quelques-unes apparaîtront gram-négatives (comme dans la figure 2.34). Cela suggère des dommages aux cellules individuelles ou que le décolorant a été laissé trop longtemps, les cellules devraient toujours être classées comme Gram-positives si elles sont toutes de la même espèce plutôt que d'une culture mixte.

Outre leurs interactions différentes avec les colorants et les agents décolorants, les différences chimiques entre les cellules gram-positives et gram-négatives ont d'autres implications avec une pertinence clinique. Par exemple, la coloration de Gram peut aider les cliniciens à classer les agents pathogènes bactériens dans un échantillon en catégories associées à des propriétés spécifiques. Les bactéries à Gram négatif ont tendance à être plus résistantes à certains antibiotiques que les bactéries à Gram positif. Nous discuterons de cela et d'autres applications de la coloration de Gram plus en détail dans les chapitres suivants.

Vérifie ta compréhension

  • Expliquez le rôle de l'iode de Gram dans la procédure de coloration de Gram.
  • Expliquer le rôle de l'alcool dans la procédure de coloration de Gram.
  • De quelle couleur sont les cellules gram-positives et gram-négatives, respectivement, après la procédure de coloration de Gram ?

Orientation clinique

Partie 3

L'observation de l'échantillon de Cindy au microscope à fond noir a fourni au technicien des indices importants sur l'identité du microbe à l'origine de son infection. Cependant, plus d'informations sont nécessaires pour établir un diagnostic concluant. Le technicien décide de faire une coloration de Gram de l'échantillon. Cette technique est couramment utilisée comme une première étape dans l'identification des bactéries pathogènes. Après avoir terminé la procédure de coloration de Gram, le technicien examine la lame au microscope à fond clair et voit des amas violets de cellules sphériques ressemblant à du raisin (figure 2.35).

  • Ces bactéries sont-elles gram-positives ou gram-négatives ?
  • Qu'est-ce que cela révèle sur leurs parois cellulaires?

Passez à la prochaine case Clinical Focus. Revenez à la case Clinical Focus précédente.

Taches acido-résistantes

La coloration acido-résistante est une autre technique de coloration différentielle couramment utilisée qui peut être un outil de diagnostic important. Une coloration acido-résistante est capable de différencier deux types de cellules gram-positives : celles qui ont des acides mycoliques cireux dans leurs parois cellulaires et celles qui n'en ont pas. Deux méthodes différentes de coloration acido-résistante sont la technique de Ziehl-Neelsen et la technique de Kinyoun. Les deux utilisent la carbolfuchsine comme colorant principal. Les cellules cireuses et acido-résistantes retiennent la carbolfuchsine même après l'application d'un agent décolorant (une solution acide-alcool). Une contre-coloration secondaire, le bleu de méthylène, est ensuite appliquée, ce qui rend les cellules non acido-résistantes bleues.

La différence fondamentale entre les deux méthodes à base de carbolfuchsine est de savoir si la chaleur est utilisée pendant le processus de coloration primaire. La méthode Ziehl-Neelsen utilise la chaleur pour infuser la carbolfuchsine dans les cellules acido-résistantes, tandis que la méthode Kinyoun n'utilise pas de chaleur. Les deux techniques sont des outils de diagnostic importants car un certain nombre de maladies spécifiques sont causées par des bactéries acido-résistantes (AFB). Si des BAAR sont présents dans un échantillon de tissu, leur couleur rouge ou rose est clairement visible sur le fond bleu des cellules tissulaires environnantes (Figure 2.36).

Vérifie ta compréhension

Micro-connexions

Utiliser la microscopie pour diagnostiquer la tuberculose

Mycobacterium tuberculosis , la bactérie qui cause la tuberculose , peut être détectée dans des échantillons basés sur la présence de bacilles acido-résistants. Souvent, un frottis est préparé à partir d'un échantillon d'expectoration du patient, puis coloré à l'aide de la technique de Ziehl-Neelsen (Figure 2.36). Si des bactéries acido-résistantes sont confirmées, elles sont généralement cultivées pour effectuer une identification positive. Des variantes de cette approche peuvent être utilisées comme première étape pour déterminer si M. tuberculose ou d'autres bactéries acido-résistantes sont présentes, bien que des échantillons provenant d'ailleurs dans le corps (comme l'urine) puissent contenir d'autres Mycobactérie espèce.

Une approche alternative pour déterminer la présence de M. tuberculose est l'immunofluorescence. Dans cette technique, les anticorps marqués au fluorochrome se lient à M. tuberculose, si présent. Des colorants fluorescents spécifiques aux anticorps peuvent être utilisés pour visualiser les mycobactéries avec un microscope à fluorescence.

Coloration des capsules

Certaines bactéries et levures ont une structure externe protectrice appelée capsule. Étant donné que la présence d'une capsule est directement liée à la virulence d'un microbe (sa capacité à provoquer une maladie), la capacité de déterminer si les cellules d'un échantillon ont des capsules est un outil de diagnostic important. Les capsules n'absorbent pas la plupart des colorants de base, c'est pourquoi une technique de coloration négative (coloration autour des cellules) est généralement utilisée pour la coloration des capsules. Le colorant tache le fond mais ne pénètre pas dans les capsules, qui apparaissent comme des auréoles autour des bords de la cellule. L'échantillon n'a pas besoin d'être fixé à chaud avant la coloration négative.

Une technique de coloration négative courante pour identifier les levures et les bactéries encapsulées consiste à ajouter quelques gouttes d'encre de Chine ou de nigrosine à un échantillon. D'autres colorants capsulaires peuvent également être utilisés pour colorer négativement les cellules encapsulées (Figure 2.37). Alternativement, des techniques de coloration positive et négative peuvent être combinées pour visualiser les capsules : la coloration positive colore le corps de la cellule et la coloration négative colore le fond mais pas la capsule, laissant un halo autour de chaque cellule.

Vérifie ta compréhension

Coloration des endospores

Les endospores sont des structures produites dans certaines cellules bactériennes qui leur permettent de survivre dans des conditions difficiles. La coloration de Gram seule ne peut pas être utilisée pour visualiser les endospores, qui apparaissent clairement lorsque les cellules colorées au Gram sont visualisées. La coloration des endospores utilise deux colorants pour différencier les endospores du reste de la cellule. La méthode de Schaeffer-Fulton (la technique de coloration des endospores la plus couramment utilisée) utilise la chaleur pour pousser la coloration primaire (vert malachite) dans l'endospore. Le lavage à l'eau décolore la cellule, mais l'endospore retient la tache verte. La cellule est ensuite contre-colorée en rose avec de la safranine. L'image résultante révèle la forme et l'emplacement des endospores, si elles sont présentes. Les endospores vertes apparaîtront soit dans les cellules végétatives roses, soit complètement séparées des cellules roses. S'il n'y a pas d'endospores, seules les cellules végétatives roses seront visibles (Figure 2.38).

Les techniques de coloration des endospores sont importantes pour identifier Bacille et Clostridium, deux genres de bactéries productrices d'endospores qui contiennent des espèces cliniquement significatives. Entre autres, B. anthracis (qui cause l'anthrax) a suscité un intérêt particulier en raison de la crainte que ses spores puissent être utilisées comme agent de bioterrorisme. C. difficile est une espèce particulièrement importante responsable de l'infection nosocomiale typique connue sous le nom de « C. diff.

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Coloration des flagelles

Les flagelles (singulier : flagelle) sont des structures cellulaires en forme de queue utilisées pour la locomotion par certaines bactéries, archées et eucaryotes. Parce qu'ils sont si minces, les flagelles ne peuvent généralement pas être vus au microscope optique sans une technique de coloration spécialisée des flagelles. La coloration des flagelles épaissit les flagelles en appliquant d'abord un mordant (généralement de l'acide tannique, mais parfois de l'alun de potassium), qui enrobe les flagelles, puis le spécimen est coloré à la pararosaniline (le plus souvent) ou à la fuchsine basique (Figure 2.39).

Bien que la coloration des flagelles soit rare en milieu clinique, la technique est couramment utilisée par les microbiologistes, car l'emplacement et le nombre de flagelles peuvent être utiles pour classer et identifier les bactéries dans un échantillon. Lors de l'utilisation de cette technique, il est important de manipuler l'échantillon avec le plus grand soin. Les flagelles sont des structures délicates qui peuvent facilement être endommagées ou arrachées, compromettant les tentatives de localisation et de comptage précis du nombre de flagelles.

Préparation des échantillons pour la microscopie électronique

Les échantillons à analyser à l'aide d'un MET doivent avoir des coupes très minces. Mais les cellules sont trop molles pour être coupées finement, même avec des couteaux en diamant. Pour couper les cellules sans dommage, les cellules doivent être noyées dans de la résine plastique puis déshydratées par une série de trempages dans des solutions d'éthanol (50 %, 60 %, 70 %, etc.). L'éthanol remplace l'eau dans les cellules, et la résine se dissout dans l'éthanol et pénètre dans la cellule, où elle se solidifie. Ensuite, des sections minces sont coupées à l'aide d'un appareil spécialisé appelé ultramicrotome (figure 2.42). Enfin, les échantillons sont fixés sur des grilles en fil de cuivre ou en fibre de carbone fines et colorés, non pas avec des colorants colorés, mais avec des substances comme l'acétate d'uranyle ou le tétroxyde d'osmium, qui contiennent des atomes de métaux lourds denses aux électrons.

Lorsque les échantillons sont préparés pour la visualisation à l'aide d'un SEM, ils doivent également être déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol. Cependant, ils doivent être encore plus secs qu'il n'est nécessaire pour un MET. Un séchage au point critique avec du dioxyde de carbone liquide inerte sous pression est utilisé pour déplacer l'eau de l'échantillon. Après séchage, les spécimens sont recouverts de métal par pulvérisation cathodique en faisant tomber des atomes d'une cible de palladium, avec des particules énergétiques. Le revêtement par pulvérisation empêche les échantillons de se charger par le faisceau d'électrons du MEB.

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  • Pourquoi est-il important de déshydrater les cellules avant de les examiner au microscope électronique ?
  • Nommez l'appareil qui est utilisé pour créer des sections minces d'échantillons pour la microscopie électronique.

Micro-connexions

Utiliser la microscopie pour diagnostiquer la syphilis

L'agent causal de la syphilis est Treponema pallidum , une cellule spirale flexible (spirochète) qui peut être très fine (<0.15 m) et correspondre à l'indice de réfraction du milieu, ce qui la rend difficile à visualiser en microscopie à fond clair. De plus, cette espèce n'a pas été cultivée avec succès en laboratoire sur un milieu artificiel. Par conséquent, le diagnostic dépend d'une identification réussie à l'aide de techniques microscopiques et de sérologie (analyse des fluides corporels, souvent à la recherche d'anticorps dirigés contre un agent pathogène). Étant donné que la fixation et la coloration tueraient les cellules, la microscopie à fond noir est généralement utilisée pour observer des spécimens vivants et visualiser leurs mouvements. Cependant, d'autres approches peuvent également être utilisées. Par exemple, les cellules peuvent être épaissies avec des particules d'argent (dans des coupes de tissus) et observées à l'aide d'un microscope optique. Il est également possible d'utiliser la fluorescence ou la microscopie électronique pour visualiser Tréponème (Figure 2.43).

En milieu clinique, l'immunofluorescence indirecte est souvent utilisée pour identifier Tréponème. Un anticorps primaire non coloré se fixe directement à la surface de l'agent pathogène et des anticorps secondaires « marqués » avec un colorant fluorescent se fixent à l'anticorps primaire. Plusieurs anticorps secondaires peuvent se fixer à chaque anticorps primaire, amplifiant la quantité de colorant attaché à chacun Tréponème cellule, ce qui les rend plus faciles à repérer (Figure 2.44).

Préparation et coloration pour d'autres microscopes

Les échantillons pour la fluorescence et la microscopie confocale sont préparés de la même manière que les échantillons pour la microscopie optique, sauf que les colorants sont des fluorochromes. Stains are often diluted in liquid before applying to the slide. Some dyes attach to an antibody to stain specific proteins on specific types of cells ( immunofluorescence ) others may attach to DNA molecules in a process called fluorescence in situ hybridization (FISH) , causing cells to be stained based on whether they have a specific DNA sequence.

Sample preparation for two-photon microscopy is similar to fluorescence microscopy, except for the use of infrared dyes. Specimens for STM need to be on a very clean and atomically smooth surface. They are often mica coated with Au(111). Toluene vapor is a common fixative.

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  • What is the main difference between preparing a sample for fluorescence microscopy versus light microscopy?

Lien vers l'apprentissage

Cornell University’s Case Studies in Microscopy offers a series of clinical problems based on real-life events. Each case study walks you through a clinical problem using appropriate techniques in microscopy at each step.

Orientation clinique

Résolution

From the results of the Gram stain, the technician now knows that Cindy’s infection is caused by spherical, gram-positive bacteria that form grape-like clusters, which is typical of staphylococcal bacteria. After some additional testing, the technician determines that these bacteria are the medically important species known as Staphylococcus aureus , a common culprit in wound infections. Because some strains of S. aureus are resistant to many antibiotics, skin infections may spread to other areas of the body and become serious, sometimes even resulting in amputations or death if the correct antibiotics are not used.

After testing several antibiotics, the lab is able to identify one that is effective against this particular strain of S. aureus. Cindy’s doctor quickly prescribes the medication and emphasizes the importance of taking the entire course of antibiotics, even if the infection appears to clear up before the last scheduled dose. This reduces the risk that any especially resistant bacteria could survive, causing a second infection or spreading to another person.

Revenez à la case Clinical Focus précédente.

Eye on Ethics

Microscopy and Antibiotic Resistance

As the use of antibiotics has proliferated in medicine, as well as agriculture, microbes have evolved to become more resistant. Strains of bacteria such as methicillin-resistant S. aureus ( MRSA ), which has developed a high level of resistance to many antibiotics, are an increasingly worrying problem, so much so that research is underway to develop new and more diversified antibiotics.

Fluorescence microscopy can be useful in testing the effectiveness of new antibiotics against resistant strains like MRSA. In a test of one new antibiotic derived from a marine bacterium, MC21-A (bromophene), researchers used the fluorescent dye SYTOX Green to stain samples of MRSA. SYTOX Green is often used to distinguish dead cells from living cells, with fluorescence microscopy. Live cells will not absorb the dye, but cells killed by an antibiotic will absorb the dye, since the antibiotic has damaged the bacterial cell membrane. In this particular case, MRSA bacteria that had been exposed to MC21-A did, indeed, appear green under the fluorescence microscope, leading researchers to conclude that it is an effective antibiotic against MRSA.

Of course, some argue that developing new antibiotics will only lead to even more antibiotic-resistant microbes, so-called superbugs that could spawn epidemics before new treatments can be developed. For this reason, many health professionals are beginning to exercise more discretion in prescribing antibiotics. Whereas antibiotics were once routinely prescribed for common illnesses without a definite diagnosis, doctors and hospitals are much more likely to conduct additional testing to determine whether an antibiotic is necessary and appropriate before prescribing.

A sick patient might reasonably object to this stingy approach to prescribing antibiotics. To the patient who simply wants to feel better as quickly as possible, the potential benefits of taking an antibiotic may seem to outweigh any immediate health risks that might occur if the antibiotic is ineffective. But at what point do the risks of widespread antibiotic use supersede the desire to use them in individual cases?


Audits and Consulting:

At Environmental Leverage ® Inc., we have a team of experienced individuals who come into your plant with a fresh pair of eyes. The system is checked from influent to effluent. System optimization, equipment efficiency and operational excellence are key components explored. Key Benefits Equipment efficiency Total Cost of Operation reductions Reliability and safety

An onsite audit is conducted to examine system parameters, process controls, and current monitor and control procedures. A physical walk-through is conducted, process flow diagrams are examined, previous design criteria are examined and current standard operating procedures are evaluated along with data logs.


Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

Source: Rhiannon M. LeVeque 1 , Natalia Martin 1 , Andrew J. Van Alst 1 , and Victor J. DiRita 1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, Michigan, United States of America

Bacteria are diverse microorganisms found nearly everywhere on Earth. Many properties help distinguish them from each other, including but not limited to Gram-staining type, shape and arrangement, production of capsule, and formation of spores. To observe these properties, one can use light microscopy however, some bacterial characteristics (for example size, lack of coloration, and refractive properties) make it hard to distinguish bacteria solely with a light microscope (1, 2). Staining bacteria is necessary when distinguishing bacterial types with light microscopy. The two main types of light microscopes are simple and compound. The main difference between them is the number of lenses used to magnify the object. Simple microscopes (for example a magnifying glass) have only one lens to magnify an object, while compound microscopes have several lenses to enhance magnification (Figure 1). Compound microscopes have an objective lens close to the object which collects light to create an image of the object. This is then magnified by the eyepiece (ocular lens) which enlarges the image. Combining the objective lens and eyepiece allows for higher magnification than using a single lens alone. Typically, compound microscopes have multiple objective lenses of varying powers to allow for different magnification (1, 2). Here, we will discuss visualizing bacteria with Gram stains, Capsule stains, and Endospore stains.


Figure 1: A typical compound microscope. The most important parts of the microscope are labeled.

The Gram stain, developed in 1884 by the Danish bacteriologist Hans Christian Gram (1), differentiates bacteria based on the composition of the cell wall (1, 2, 3, 4). Briefly, a bacterial smear is placed on a microscope slide and then heat-fixed to adhere the cells to the slide and make them more readily accepting of stains (1). The heat-fixed sample is stained with Crystal Violet, turning the cells purple. The slide is flushed with an Iodine solution, which fixes the Crystal Violet to the cell wall, followed by a decolorizer (an alcohol) to wash away any non-fixed Crystal Violet. In the final step, a counterstain, Safranin, is added to color cells red (Figure 2). Gram-positive bacteria stain purple due to the thick peptidoglycan layer which is not easily penetrated by the decolorizer Gram-negative bacteria, with their thinner peptidoglycan layer and higher lipid content, destain with the decolorizer and are counterstained red when Safranin is added (Figure 3). Gram staining is used to differentiate cells into two types (Gram-positive and Gram-negative) and is also useful to distinguish cell shape (spheres or cocci, rods, curved rods, and spirals) and arrangement (single cells, pairs, chains, groups, and clusters) (1, 3).


Figure 2: Schematic of the Gram Staining Protocol. The left column shows how Gram-negative bacteria react at each step of the protocol. The right column shows how Gram-positive bacteria react. Also, shown are two typical bacterial cell shapes: the bacilli (or rods) and the cocci (or spheres).


Figure 3: Gram Staining Results. A Gram stain of a mixture of Staphylococcus aureus (Gram-positive purple cocci) and Escherichia coli (Gram-negative red rods).

Some bacteria produce an extracellular viscous outer layer called a capsule (3, 5). Capsules are protective structures with various functions, including but not limited to adherence to surfaces and other bacteria, protection from desiccation, and protection from phagocytosis. Capsules are typically composed of polysaccharides containing more than 95% water, but some may contain polyalcohols and polyamines (5). Due to their mostly non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods do not work with capsule instead, capsule staining uses a negative staining technique which stains the cells and the background, leaving the capsule as a clear halo around the cells (1, 3) (Illustration 4). Capsule staining involves smearing a bacterial sample into an acidic stain on a microscope slide. Unlike Gram staining, the bacterial smear is not heat-fixed during a Capsule Stain. Heat-fixing can disrupt or dehydrate the capsule, leading to false negatives (5). Furthermore, heat-fixing can shrink cells resulting in a clearing around the cell which can be mistaken as a capsule, leading to false positives (3). The acidic stain colors the slide background while follow up with a basic stain, Crystal Violet, colors the bacterial cells themselves, leaving the capsule unstained and appearing as a clear halo between the cells and the slide background (Illustration 5). Traditionally, India ink has been used as the acidic stain because these particles cannot penetrate the capsule. Therefore, neither the capsule nor the cell is stained by India ink instead, the background is stained. Congo Red, Nigrosin, or Eosin can be used in place of India ink. Capsule staining can help doctors diagnose bacterial infections when looking at cultures from patient samples and guide appropriate patient treatment. Common diseases caused by encapsulated bacteria include pneumonia, meningitis, and salmonellosis.


Figure 4: Schematic of the Capsule Staining Protocol. The top panel shows the slide smear prior to any stain application. The middle panel shows how the slide and bacteria look after the primary stain, Congo Red. The final panel shows how the slide and bacteria look after the counterstain, Crystal Violet.


Figure 5: Capsule Staining Results. Capsule staining of encapsulated Acinetobacter baumannii (denoted with black arrows) and non-encapsulated Escherichia coli (denoted with white arrows). Notice the background is dark and A. baumannii cells are stained purple. The capsule around A. baumannii cells is evident as a halo, while E. coli has no halo.

In adverse conditions (for example nutrient limitation, extreme temperatures, or dehydration), some bacteria produce endospores, metabolically inactive structures that are resistant to physical and chemical damage (1, 2, 8, 9). Endospores allow the bacterium to survive harsh conditions by protecting the genetic material of the cells once conditions are favorable for growth, spores germinate, and bacterial growth continues. Endospores are difficult to stain with standard staining techniques because they are impermeable to dyes typically used for staining (1, 9). The technique routinely used to stain endospores is the Schaeffer-Fulton Method (Figure 6), which uses the primary stain Malachite Green, a water soluble stain that binds relatively weakly to cellular material, and heat, to allow the stain to break through the cortex of the spore (Figure 7). These steps color the growing cells (termed vegetative cells in the context of endospore biology), as well as endospores and any free spores (those no longer within the former cell envelope). Vegetative cells are washed with water to remove Malachite Green endospores retain the stain due to heating the Malachite Green within the spore. Finally, the vegetative cells are counterstained with Safranin to visualize (Figure 8). Staining for endospores helps differentiate bacteria into spore formers and non-spore formers, as well as determines whether spores are present in a sample which, if present, could lead to bacterial contamination upon germination.


Figure 6: Schematic of the Endospore Staining Protocol. The left column shows how spore forming bacteria react at each step of the protocol. The right column shows how non-spore forming bacteria react.


Figure 7: Diagram of Endospore Structure. Bacterial cell containing an endospore with the various spore structures labeled.


Figure 8: Endospore Staining Results. A typical staining of endospores of Bacillus subtilis. The vegetative cells (denoted with the white arrows) are stained red, while the endospores (denoted with the black arrows) are stained green.

Procédure

1. Gram Staining

  1. Set-up
    1. Wear gloves and a non-flammable lab coat, as dyes will stain hands and clothing.
    2. A Bunsen burner is used to heat fix the bacteria. Use care when working with flame tie back long hair.
    3. Commercially available Gram stain reagents will be used.
    4. Clean microscope slides with laboratory wipes.
    1. Pipet 10 µL phosphate buffered saline or culture broth on slide.
    2. Smear a bacterial colony into the liquid to produce a thin even layer.
      Noter: Do not use cultures older than 24 hours, as bacteria too old could have changes in their cell wall which will affect the Gram stain results (1, 4).
    3. Completely air-dry slide.
    4. Once dried, heat fix bacteria by passing slide through the flame (bacteria side up) 4-5 times.
      Noter: Do not hold the slide in the flame too long or you can distort the bacterial cells (1).
    5. Working over the sink, hold the slide level and apply Gram's Crystal Violet to completely cover the heat-fixed bacteria, allow to stand 45 seconds.
    6. Rinse excess Crystal Violet by holding the slide at an angle and squirting a gentle, indirect stream of water onto the slide and letting it run down over the stained bacteria. Do not squirt water directly onto the bacteria.
    7. Holding slide level again, apply Gram's Iodine Solution to completely cover the stained bacteria, allow to stand 45 seconds.
    8. Rinse excess Iodine as in step 1.2.6 above.
    9. While holding the slide at an angle, add a few drops of Decolorizer onto the slide, letting it trickle down over the stained bacteria just until the runoff is clear typically, about 5 seconds. Immediately rinse with water as in step 1.2.6 above.
      Noter: This is a critical step in the protocol. Allowing Decolorizer to trickle too long or not long enough will result in false Gram-staining (4).
    10. Holding the slide level again, apply Gram's Safranin to completely cover the bacteria, allow to stand 45 seconds.
    11. Rinse excess Safranin as in step 1.2.6 above.
    12. Blot, do not rub, excess water from slide using paper towels.
    13. Examine slide on the microscope using oil-immersion with a 100X objective.
    1. Gram-positive bacteria will stain purple.
    2. Gram-negative bacteria will stain red.
    3. Shape (cocci, bacilli, curved rods, spirals) of bacteria will be visible.
    4. Arrangement of bacterial cells (single cells, paired cells, chains of cells, clusters, groupings) will be visible.

    2. Capsule Staining

    1. Set-up
      1. Wear gloves and a lab coat as dyes stain hands and clothing.
      2. To prepare 1% Crystal Violet solution, mix 0.25 gram Crystal Violet with 25 mL distilled water until dissolved.
      3. To prepare 1% Congo Red solution, mix 0.25 gram Congo Red with 25 mL distilled water until dissolved.
      4. Clean slides with laboratory wipes.
      1. Place 10 µL Congo Red on slide.
      2. Using a pipet tip, smear a bacterial colony into the dye to produce a thin even layer.
      3. Completely air-dry slide with dye/cell mixture, 5-7 minutes.
        Noter: Do not heat fix as heating can dehydrate or distort the capsule.
      4. Flood the smear with 1% Crystal Violet for 1 minute.
      5. Rinse excess stain by holding the slide at an angle and squirting a gentle, indirect stream of water onto the slide and letting it run down over the stained bacteria. Do not squirt water directly onto the bacteria.
      6. Hold the slide at a 45-degree angle until completely air-dried.
      7. Examine smear on the microscope under oil-immersion with a 100X objective.
      1. Bacterial cells will stain purple.
      2. Background of the slide will stain dark.
      3. Capsules will be a clear halo around cells against a dark background.

      3. Endospore Staining (Schaeffer-Fulton method)

      1. Set-up
        1. Wear gloves and non-flammable lab coat to protect hands and clothing from dyes and flame.
        2. A Bunsen burner is used to heat fix the bacteria. Use care when working with flame tie back long hair.
        3. To prepare 0.5% Malachite Green solution, mix 0.125 grams Malachite Green with 25 mL distilled water until dissolved.
        4. Use commercially available Gram's Safranin reagent solution.
        5. Clean slides with laboratory wipes.
        1. Pipet 10 µl phosphate buffered saline (PBS) or culture broth onto slide.
        2. Using aseptic technique, smear a bacterial colony into the liquid to produce a thin even layer.
          Noter: Endospores generally do not form in young cells, therefore the culture is recommended to be between 18 and 36 hours old (9).
        3. Completely air-dry slide.
        4. Heat fix by passing slide (bacteria side up) through flame 4-5 times.
        5. To help contain the dye, place a piece of lens paper (cut to fit the bacterial smear) over the heat fixed smear.
        6. Saturate lens paper with Malachite Green solution.
        7. Place slide on top of beaker of boiling water on a hot plate, and steam slide for 5 minutes, keeping lens paper moist by adding more dye a drop at a time as needed.
          Noter: Avoid overheating and drying out the dye solution.
        8. Remove slide from beaker, remove and discard lens paper, allow slide to cool 2 minutes.
        9. Holding slide at an angle, rinse thoroughly by squirting a gentle, indirect stream of water onto slide, allowing it to drain down over smear.
        10. Holding slide level, flood smear with Safranin, allow to stand 1 minute.
        11. Rinse excess Safranin as in step 3.2.9 above.
        12. Allow to air-dry.
        13. Examine slide on microscope under oil-immersion with a 100X objective.
        1. Spores will stain green.
        2. Vegetative cells will stain red.
        3. Some vegetative cells will contain spores the cells will stain red, while the endospores will stain green.

        Bacteria are microscopic living organisms that have many distinguishing characteristics such as shape, arrangement of cells, whether or not they produce capsules, and if they form spores. These features can all be visualized by staining and aid in the identification and classification of different bacterial species.

        To examine the first two characteristics of cell shape and arrangement, we can use a simple technique called Gram staining. Here, crystal violet is applied to bacteria, which have been heat-fixed onto a slide. A decolorizer is then applied and any bacteria with a thick peptidoglycan layer will stain purple, as this layer is not easily penetrated by the decolorizer. These bacteria are referred to as Gram positive.

        Gram negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and will de-stain the decolorizer, losing the purple color. However, they will stain reddish-pink when a safranin counter stain is added, which binds to a lipopolysaccharide layer on their outside. Once stained, the cells can be observed for morphology, size, and arrangement, such as in chains or clusters, which further aids in classification and identification.

        Another useful technique in the microbiologist's toolkit is the capsule stain, used to visualize external capsules that surround some types of bacterial cells. Due to the capsules non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods won't work. Instead, a negative staining technique is used, which first stains the background with an acidic colorant, such as Congo red, before the bacterial cells are stained with crystal violet. This leaves any capsule present as a clear halo around the cells.

        The final major staining technique covered here can help determine if the bacteria being studied forms spores. In adverse conditions, some bacteria produce endospores, dormant, tough, non-reproductive structures, whose primary function is to ensure the survival of bacteria through periods of environmental stress, like extreme temperatures or dehydration. However, not all bacterial species make endospores, and they are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to many dyes. The Schaeffer-Fulton method uses malachite green stain, which is applied to the bacteria fixed to a slide. The slide is then washed with water before being counter stained with safranin. Vegetative cells will appear pinkish-red, while any endospores present will appear green. In this video, you will learn how to perform these common bacterial staining techniques and then examine the staining samples using light microscopy.

        To begin the procedure, tie back long hair and put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves.

        Then, clean a fresh microscope slide with a laboratory wipe. Next, pipette 10 microliters of 1X phosphate buffered saline onto the first slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacterial colony in the liquid to produce a thin, even layer. Set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry.

        Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Using tongs, pass the slide through the burner flame several times, with the bacteria side up, taking care not to hold the slide in the flame too long, which may distort the cells.

        Now, working over the sink, hold the slide level and apply several drops of Gram's crystal violet to completely cover the bacterial smear and then, place the slide onto the bench to stand for 45 seconds. Next, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacterial smear directly. Now, holding the slide level again, apply Gram's iodine solution to completely cover the stained bacteria and then, allow it to stand for another 45 seconds. Next, carefully rinse the iodine from the slide, as shown previously. While holding the slide at an angle, add a few drops of Gram's decolorizer to the slide, allowing it to run down over the stained bacteria, just until the run-off is clear, for approximately 5 seconds. Immediately, rinse with water as shown previously. This will limit over-decolorizing the smear. Next, holding the slide level again, apply Gram's safranin counter-stain to completely cover the stained bacteria. After 45 seconds, gently rinse the safranin from the slide with water, as shown previously, and then, blot dry with paper towels.

        Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective lens.

        To begin this staining protocol, first put on the correct personal protective equipment, and then, ensure that the glass slides that will be used are clean.

        Next, prepare the solutions. To make 1% crystal violet solution, mix 0.25 grams of crystal violet powder with 25 milliliters of distilled water, and vortex until dissolved. Then, prepare 1% Congo red solution by mixing 0.25 grams of Congo red powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Now, pipette 10 microliters of the Congo red solution onto the slide. Using a clean, sterile pipette tip, select a single bacterial colony from the LB agar plate. Then, smear the bacterial colony into the dye to produce a thin, even layer. Completely air dry the bacterial slide for 5-7 minutes. Once the slide is dry, flood the smear with enough 1% crystal violet to cover the smear and let it sit for 1 minute. Now, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacteria directly. Continue holding the slide at a 45 degree angle until completely air dried. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective.

        To perform endospore staining, first, prepare a 0.5% malachite green solution by mixing 0. 125 grams of malachite green powder with 25 milliliters of distilled water, and then vortex the solution until dissolved. Next, pipette 10 microliters of 1X PBS onto the center of the slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacteria into the liquid to produce a thin, even layer. Now, set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry. Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Pass the slide through the blue burner flame several times, with the bacteria side facing up. Then, once the slide has cooled, place a piece of precut lens paper over the heat fixed smear. Next, turn on a hotplate to the highest setting, and bring a beaker of water to a boil.

        Saturate the lens paper with the malachite green solution and, using tongs, place the slide on top of the beaker of boiling water to steam for 5 minutes. Keep the lens paper moist by adding more dye, one drop at a time, as needed. Next, again using tongs, pick up the slide from the beaker and remove and discard the lens paper. Allow the slide to cool for 2 minutes. Working over the sink, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide. Now, hold the slide level and apply safranin to completely cover the slide. Then, allow it to stand for 1 minute. Next, hold the slide at an angle and rinse as previously shown. Allow the slide to air dry on the bench top. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide with a light microscope, with a 100X oil objective.

        In the Gram staining protocol, two different colored stains can result. Dark purple staining indicates that the bacteria are Gram-positive, and that they have retained the crystal violet stain. In contrast, reddish-pink staining is a characteristic of Gram-negative bacteria, which instead will be colored by the safranin counter stain. Additionally, different shapes and arrangements of bacteria can be visualized after Gram staining. For example, it is possible to differentiate Cocci, or round bacteria, from rod-shaped Bacillus, or identify bacteria which forms strands, compared to those which typically aggregate as clumps, or occur singly.

        In a capsule stained microscope image, the bacterial cells will typically be stained purple, and the background of the slide should be darkly stained. Against this dark background, the capsules of the bacteria, if present, will appear as a clear halo around the cells.

        Lastly, in endospore staining, Vegetative cells will be stained red by the safranin counter stain. If endospores are present in the sample, these will retain the malachite green stain, and appear bluish-green in color.

        Applications and Summary

        Bacteria have distinguishing characteristics that can aid in their identification. Some of these characteristics can be observed by staining and light microscopy. Three staining techniques useful for observing these characteristics are Gram staining, Capsule staining, and Endospore staining. Each technique identifies different characteristics of bacteria and can be used to help physicians recommend treatments for patients, identify potential contaminants in samples or food products, and verify sample sterility.

        Les références

        1. Black, J. G. Microbiology Principles and Explorations, 4 th edition. Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River, New Jersey. (1999)
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        9. Hussey, M. A. and A. Zayaitz. Endospore Stain Protocol. Laboratory Protocols. American Society for Microbiology, Washington, DC. Available from: http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3112. (2007).

        Transcription

        Bacteria are microscopic living organisms that have many distinguishing characteristics such as shape, arrangement of cells, whether or not they produce capsules, and if they form spores. These features can all be visualized by staining and aid in the identification and classification of different bacterial species.

        To examine the first two characteristics of cell shape and arrangement, we can use a simple technique called Gram staining. Here, crystal violet is applied to bacteria, which have been heat-fixed onto a slide. A decolorizer is then applied and any bacteria with a thick peptidoglycan layer will stain purple, as this layer is not easily penetrated by the decolorizer. These bacteria are referred to as Gram positive.

        Gram negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and will de-stain the decolorizer, losing the purple color. However, they will stain reddish-pink when a safranin counter stain is added, which binds to a lipopolysaccharide layer on their outside. Once stained, the cells can be observed for morphology, size, and arrangement, such as in chains or clusters, which further aids in classification and identification.

        Another useful technique in the microbiologist's toolkit is the capsule stain, used to visualize external capsules that surround some types of bacterial cells. Due to the capsules non-ionic composition and tendency to repel stains, simple staining methods won't work. Instead, a negative staining technique is used, which first stains the background with an acidic colorant, such as Congo red, before the bacterial cells are stained with crystal violet. This leaves any capsule present as a clear halo around the cells.

        The final major staining technique covered here can help determine if the bacteria being studied forms spores. In adverse conditions, some bacteria produce endospores, dormant, tough, non-reproductive structures, whose primary function is to ensure the survival of bacteria through periods of environmental stress, like extreme temperatures or dehydration. However, not all bacterial species make endospores, and they are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to many dyes. The Schaeffer-Fulton method uses malachite green stain, which is applied to the bacteria fixed to a slide. The slide is then washed with water before being counter stained with safranin. Vegetative cells will appear pinkish-red, while any endospores present will appear green. In this video, you will learn how to perform these common bacterial staining techniques and then examine the staining samples using light microscopy.

        To begin the procedure, tie back long hair and put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves.

        Then, clean a fresh microscope slide with a laboratory wipe. Next, pipette 10 microliters of 1X phosphate buffered saline onto the first slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacterial colony in the liquid to produce a thin, even layer. Set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry.

        Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Using tongs, pass the slide through the burner flame several times, with the bacteria side up, taking care not to hold the slide in the flame too long, which may distort the cells.

        Now, working over the sink, hold the slide level and apply several drops of Gram's crystal violet to completely cover the bacterial smear and then, place the slide onto the bench to stand for 45 seconds. Next, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacterial smear directly. Now, holding the slide level again, apply Gram's iodine solution to completely cover the stained bacteria and then, allow it to stand for another 45 seconds. Next, carefully rinse the iodine from the slide, as shown previously. While holding the slide at an angle, add a few drops of Gram's decolorizer to the slide, allowing it to run down over the stained bacteria, just until the run-off is clear, for approximately 5 seconds. Immediately, rinse with water as shown previously. This will limit over-decolorizing the smear. Next, holding the slide level again, apply Gram's safranin counter-stain to completely cover the stained bacteria. After 45 seconds, gently rinse the safranin from the slide with water, as shown previously, and then, blot dry with paper towels.

        Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective lens.

        To begin this staining protocol, first put on the correct personal protective equipment, and then, ensure that the glass slides that will be used are clean.

        Next, prepare the solutions. To make 1% crystal violet solution, mix 0.25 grams of crystal violet powder with 25 milliliters of distilled water, and vortex until dissolved. Then, prepare 1% Congo red solution by mixing 0.25 grams of Congo red powder with 25 milliliters of distilled water and vortex until dissolved. Now, pipette 10 microliters of the Congo red solution onto the slide. Using a clean, sterile pipette tip, select a single bacterial colony from the LB agar plate. Then, smear the bacterial colony into the dye to produce a thin, even layer. Completely air dry the bacterial slide for 5-7 minutes. Once the slide is dry, flood the smear with enough 1% crystal violet to cover the smear and let it sit for 1 minute. Now, hold the slide at an angle and gently squirt a stream of water onto the top of the slide, taking care not to squirt the bacteria directly. Continue holding the slide at a 45 degree angle until completely air dried. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide using a light microscope with a 100X oil objective.

        To perform endospore staining, first, prepare a 0.5% malachite green solution by mixing 0. 125 grams of malachite green powder with 25 milliliters of distilled water, and then vortex the solution until dissolved. Next, pipette 10 microliters of 1X PBS onto the center of the slide. Then, use a sterile pipette tip to select a single bacterial colony from the LB agar plate. Smear the bacteria into the liquid to produce a thin, even layer. Now, set the slide on the bench top, and allow it to fully air dry. Once dried, light a Bunsen burner to heat fix the bacteria. Pass the slide through the blue burner flame several times, with the bacteria side facing up. Then, once the slide has cooled, place a piece of precut lens paper over the heat fixed smear. Next, turn on a hotplate to the highest setting, and bring a beaker of water to a boil.

        Saturate the lens paper with the malachite green solution and, using tongs, place the slide on top of the beaker of boiling water to steam for 5 minutes. Keep the lens paper moist by adding more dye, one drop at a time, as needed. Next, again using tongs, pick up the slide from the beaker and remove and discard the lens paper. Allow the slide to cool for 2 minutes. Working over the sink, hold the slide at an angle, and gently squirt a stream of water onto the top of the slide. Now, hold the slide level and apply safranin to completely cover the slide. Then, allow it to stand for 1 minute. Next, hold the slide at an angle and rinse as previously shown. Allow the slide to air dry on the bench top. Finally, add a drop of immersion oil directly to the slide, and then, examine the slide with a light microscope, with a 100X oil objective.

        In the Gram staining protocol, two different colored stains can result. Dark purple staining indicates that the bacteria are Gram-positive, and that they have retained the crystal violet stain. In contrast, reddish-pink staining is a characteristic of Gram-negative bacteria, which instead will be colored by the safranin counter stain. Additionally, different shapes and arrangements of bacteria can be visualized after Gram staining. For example, it is possible to differentiate Cocci, or round bacteria, from rod-shaped Bacillus, or identify bacteria which forms strands, compared to those which typically aggregate as clumps, or occur singly.

        In a capsule stained microscope image, the bacterial cells will typically be stained purple, and the background of the slide should be darkly stained. Against this dark background, the capsules of the bacteria, if present, will appear as a clear halo around the cells.

        Lastly, in endospore staining, Vegetative cells will be stained red by the safranin counter stain. If endospores are present in the sample, these will retain the malachite green stain, and appear bluish-green in color.


        Colloidal Iron

        The colloidal iron technique is based upon the attraction of positively charged iron ions (ferric cations) for the negatively charged carboxylate and sulfate group endings in acidic mucins. The bound ferric ions are detected or visualized by subsequent treatment with potassium ferrocyanide to form bright blue deposits of ferric ferrocyanide or Prussian blue. While the colloidal iron technique is an extremely sensitive method for the detection of acid mucins, it is not as frequently used as other techniques such as Alcian blue. However, like Alcian blue the colloidal iron technique may be used in combination with the periodic acid also known as the Schiff technique.


        Voir la vidéo: روتيني الليلي ههههه coloration de gram et préparation dATB (Octobre 2022).