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J'ai fait une électrophorèse sur gel d'agar mais je n'ai pas pu voir l'ADN, pourquoi ?

J'ai fait une électrophorèse sur gel d'agar mais je n'ai pas pu voir l'ADN, pourquoi ?


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Après avoir effectué une PCR, j'ai passé les produits (700 pb) dans une électrophorèse sur gel d'agar avec une échelle Genedirex (100 pb), mais le transilluminateur ne les a pas révélés.


Une raison courante pour laquelle vous ne pouvez pas voir votre ADN est que vous n'avez pas mis d'EtBr / GelRed dans votre gel. Avez-vous suffisamment de produit PCR pour l'exécuter sur un autre gel d'agarose ?


Je pense que vous devriez vérifier si vous avez ajouté les deux suivants avant de charger sur un gel

  1. EtBr

  2. Chargement du colorant

Comme vous ne pouvez pas non plus voir l'échelle, la quantité de produits PCR n'est peut-être pas la raison.


Agarose versus polyacrylamide : tous les gels ne sont pas égaux

Comme les athlètes qui courent sur du gazon contre du sable, le gel dans lequel vous faites passer votre ADN peut grandement affecter vos résultats.

Les deux principaux types de gels que les gens utilisent pour l'électrophorèse de l'ADN sont les gels d'agarose et de polyacrylamide (PA), mais comprendre les différences peut être déroutant.

Fondamentalement, vous choisissez un gel en fonction de deux facteurs principaux : à quelle hauteur vous avez besoin de la résolution et ce qu'il y a dans vos échantillons. Pour rendre le choix plus simple, j'ai fait un tableau pratique décrivant les différences entre eux.

* L'électrophorèse en champ pulsé est une technique dans laquelle la direction du courant dans la chambre d'électrophorèse est périodiquement modifiée. Cela permet le fractionnement de morceaux d'ADN allant de 50 000 à 5 millions de pb.

Utilisez ce tableau pour vous aider à comprendre les différences entre les deux types de gel et vos échantillons fonctionneront comme des athlètes en un rien de temps !

Cela vous a-t-il aidé ? Alors s'il vous plaît partagez avec votre réseau.

2 commentaires

cela m'intéresse et aussi je l'ai bien utilisé merci

[…] champignons et espèces de graines d'orchidées. Les produits d'agarose synthétique utilisés pour fabriquer des gels d'ADN ont également des avantages et des inconvénients - les inconvénients étant que l'acrylamide (sous forme de poudre ou de solution) est une neurotoxine, des bulles peuvent se former dans les gels […]

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Un médecin légiste est assis dans son laboratoire avec trois échantillons d'ADN devant elle. Un échantillon est l'ADN laissé sur les lieux du crime par le criminel, les deux autres échantillons sont l'ADN de suspects potentiels. Comment déterminera-t-elle si l'ADN de l'un ou l'autre des suspects correspond à l'ADN de la scène de crime ? La scientifique sait qu'elle peut utiliser une enzyme pour couper chaque échantillon d'ADN à une séquence particulière de nucléotides, ce qui laissera plusieurs morceaux d'ADN différents. Le nombre exact de pièces et leurs tailles seront uniques à chaque individu. Cela signifie qu'il y aura une correspondance exacte dans le schéma des morceaux d'ADN de différentes tailles entre l'un des suspects et l'ADN laissé sur les lieux du crime, mais pas avec l'ADN d'autres suspects. Le seul problème qui reste est, comment va-t-elle « voir » et « mesurer » les différents morceaux d'ADN dans chaque échantillon ? Vous avez peut-être vu une telle scène dans l'émission télévisée CSI. La réponse est l'électrophorèse sur gel !

Électrophorèse sur gel est une technique utilisée pour séparer et visualiser des macromolécules. Macromolécules sont de "grosses" molécules, telles que ADN, ARN, et protéines. Au cours de l'électrophorèse sur gel, les macromolécules (ADN dans l'exemple médico-légal ci-dessus) sont chargées dans un gel. Ensuite, un courant est appliqué à travers le gel. Le résultat est une séparation des macromolécules, basée sur Masse. Afin de "voir" les macromolécules dans le gel, les scientifiques ajoutent soit des colorants, qui tachent la zone du gel qui contient les macromolécules, soit des produits chimiques qui lient les macromolécules et deviennent fluorescents lorsque le gel est exposé à la lumière ultraviolette.

Alors, comment fonctionne l'électrophorèse sur gel ? Elle repose sur le principe que acides nucléiques, comme l'ADN et l'ARN, sont chargés négativement. Cela signifie que si vous mettez des acides nucléiques dans un champ électrique, ils migreront de l'extrémité négative du champ vers l'extrémité positive. Les acides nucléiques sont placés à l'intérieur du gel pour deux raisons principales. Premièrement, le gel est un moyen de les retenir pour savoir où ils se trouvent. Deuxièmement, la migration doit se produire d'une manière qui permet la séparation de morceaux d'ADN ou d'ARN de différentes tailles. Le gel a de nombreux trous microscopiques à travers lesquels les acides nucléiques se tortillent lorsqu'ils migrent dans le champ électrique. Plus la séquence d'acides nucléiques est petite, plus il lui est facile de se faufiler à travers les trous. Ainsi, de plus petits morceaux d'ADN et d'ARN « passent » à travers le gel plus rapidement que des morceaux plus gros. Pour en revenir à notre exemple de médecine légale, cela signifie que les morceaux individuels d'ADN dans chaque échantillon sont triés dans le gel et que les plus gros morceaux apparaissent en haut de la chambre et les plus petits au fond de la chambre. Le scientifique compare le motif des morceaux d'ADN de la scène de crime au motif de l'ADN des suspects et cherche à voir s'il y a une correspondance exacte.

L'électrophorèse sur gel de protéines fonctionne de manière similaire, sauf que les protéines ne sont pas toujours chargées négativement. Afin de forcer les protéines à migrer vers l'extrémité positive du champ électrique, les protéines sont dénaturé, forcé de se déployer, en présence d'un produit chimique qui enrobe la protéine de charges négatives. La quantité de revêtement est relative à la taille de la protéine, ce qui signifie que la charge négative totale est plus importante dans les protéines plus grosses. En utilisant cette technique, les protéines, comme les acides nucléiques, peuvent être séparées en fonction de la masse.

L'électrophorèse sur gel est une technique courante dans les laboratoires et a de nombreuses utilisations, y compris l'exemple médico-légal ci-dessus. Les utilisations les plus courantes sont :

  • Tri des pools de macromolécules pour déterminer le nombre de macromolécules différentes dans un échantillon.
  • Déterminer la taille exacte d'une macromolécule. Cela peut être fait en exécutant un mélange de molécules de tailles connues, appelé un échelle, dans le même gel que la macromolécule que vous souhaitez mesurer. Ensuite, vous pouvez déterminer quelle molécule connue de l'échelle est la plus proche en termes de schéma de migration de la molécule inconnue, ainsi, une taille approximative.
  • Purification d'un seul type de macromolécule.

Par exemple, un scientifique peut vouloir en savoir plus sur les protéines qu'une bactérie libère dans l'environnement. Pour ce faire, le scientifique collecte le milieu liquide dans lequel la bactérie se développe et analyse un échantillon du milieu dans un gel pour déterminer le nombre de protéines qu'il contient. Peut-être que le scientifique veut connaître l'identité de l'une des protéines. Sur la base de la taille, le scientifique peut être en mesure de deviner quelles sont certaines de ces protéines pour vérifier s'il a raison, le scientifique peut profiter du fait que la protéine est maintenant "piégée" dans le gel. En découpant la région du gel contenant la protéine de la taille qui l'intéresse et en utilisant d'autres techniques pour séparer le gel de la protéine, il peut purifier la protéine et utiliser cet échantillon pur pour une expérimentation plus poussée.

L'équipement pour l'électrophorèse sur gel est assez simple. Il y a une chambre pour contenir le gel réel. La chambre a à la fois positif et négatif électrodes auquel vous connectez une source d'alimentation afin de créer le champ électrique. Le gel est immergé dans une solution tampon, qui fournit des ions pour transporter le courant et maintient le pH assez constant. L'échantillon est chargé dans des puits dans le gel.


Figure 1. Cette chambre d'électrophorèse sur gel est reliée à une alimentation électrique par des fils noir et rouge. Le fil rouge est attaché à l'électrode positive, les échantillons se dirigeront vers l'électrode positive lorsque l'alimentation est allumée. (Photo de Jeffrey M. Vinocur, 21 avril 2006.)

Dans ce projet scientifique, vous construirez votre propre chambre d'électrophorèse sur gel. Une fois qu'il sera construit, vous pourrez examiner différents colorants alimentaires et explorer certaines des questions suivantes. Pour un aperçu de ce à quoi ressemblera l'expérience, regardez la vidéo ci-dessous. Combien de macromolécules différentes composent chaque colorant alimentaire ? Il n'y en a qu'un par couleur ? Quelle couleur traverse le gel le plus rapidement ? Différentes marques de colorants alimentaires contiennent-elles les mêmes macromolécules ? Vous pourriez être surpris par les résultats !


Échantillon 6B DNA Lab AP

Introduction:
Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui coupent en fait les liaisons phosphodiester sur les côtés de l'acide désoxyribonucléique. Ces endonucléases reconnaissent des séquences d'ADN spécifiques dans l'ADN double brin, qui est généralement une séquence de quatre à six paires de bases de nucléotides. Les endonucléases digèrent ensuite l'ADN à ces sites. Le produit résultant est généralement des fragments d'ADN de différentes longueurs. Certaines enzymes de restriction coupent proprement la double hélice d'ADN tandis que d'autres produisent des extrémités inégales ou collantes. En utilisant la même enzyme de restriction pour couper l'ADN de différents organismes, les extrémités cohésives produites seront complémentaires et l'ADN des deux sources différentes pourra être recombiné. Chez l'homme, aucun individu n'a exactement le même schéma d'enzymes de restriction dans l'ADN, à l'exception des jumeaux identiques. Dans l'ADN, les brins antiparallèles sont difficiles à traiter compte tenu des enzymes de restriction coupées dans des directions opposées. C'est la raison des fins complémentaires. Les enzymes de restriction sont nommées selon un système de nomenclature. La première lettre représente le nom de genre de l'organisme. Les deux lettres suivantes proviennent du nom de l'espèce. S'il y a une quatrième lettre, elle représente la souche de l'organisme. Enfin, s'il existe des chiffres romains, cela indique si cette enzyme particulière était la première ou la deuxième, etc. isolée dans cette catégorie.
Dans la chambre d'électrophorèse, on place un gel d'agar. Ce gel contient des puits pour les échantillons d'ADN. Le gel d'agarose est recouvert d'un tampon afin que l'ADN soit dans une solution à pH neutre. De cette façon, l'ADN se déplace dans la direction où sa charge le force. Étant donné que les groupes phosphate sur le squelette de l'ADN sont chargés négativement, la molécule entière prend la charge négative. Ainsi, lorsque l'ADN est placé à l'intérieur du gel et que l'électricité est allumée de sorte que les pôles attirent l'ADN vers le côté positif, il se déplacera à travers le gel et se séparera en fonction de la taille des fragments.

Hypothèse:
Au moyen d'une électrophorèse, les fragments d'ADN de lambda peuvent être séparés par le déplacement des fragments à travers un gel d'agar en fonction de la taille des fragments.

Matériaux:
Les matériaux nécessaires pour ce laboratoire sont les suivants : une chambre d'électrophorèse, un gel d'agarose, de l'ADN lambda digéré avec des endonucléases, un colorant de suivi, une micropipette et des pointes, un tampon de fonctionnement et une alimentation électrique.

Méthodes :
Préparez le gel d'agar pour l'électrophorèse en le passant au micro-ondes pendant la durée suggérée. Lorsque le gel a suffisamment durci, placez-le dans la chambre, versez le tampon de coulée sur le gel et ajoutez les échantillons d'ADN dans les puits avec une micropipette. Ensuite, réglez la tension correcte et allumez l'électricité. Laissez-le fonctionner jusqu'à ce que l'ADN soit presque à la fin du gel, mais ne le laissez pas s'écouler complètement. Ensuite, procurez-vous la tache et un plateau de coloration et laissez le gel reposer dans la tache pendant un moment. Ensuite, mettez le gel dans de l'eau distillée afin que la tache puisse être retirée du gel lui-même, laissant l'ADN coloré en bleu royal. Regardez et mesurez le gel sur une boîte à lumière, et mettez les données dans le tableau de données.


Dans la précipitation, il est facile d'oublier d'ajouter du bromure d'éthidium à votre agarose avant de couler le gel. Sans cela, bien sûr, il sera impossible de visualiser votre ADN. Heureusement, vous pouvez récupérer un gel non taché une fois qu'il a fini de couler en le trempant dans un tampon contenant du bromure d'éthidium. En fait, certaines personnes préfèrent même le tacher par la suite, même si vous aurez alors un grand volume de déchets de bromure d'éthidium à éliminer (heureusement, il peut être réutilisé plusieurs fois avant de devoir vous en débarrasser).

Le pourcentage standard d'agarose utilisé pour séparer l'ADN est de 1,0 %. L'utilisation de plus d'agarose dans un gel améliore la résolution des bandes plus petites, tandis qu'un pourcentage d'agarose inférieur permet aux bandes plus petites de traverser rapidement le gel, vous offrant ainsi une meilleure résolution et une meilleure séparation des bandes plus grandes. Si le mauvais pourcentage est utilisé, il peut être difficile de visualiser vos bandes. Soyez prudent lorsque vous utilisez un pourcentage d'agarose inférieur à 0,8%, car ces gels deviendront plus faibles et beaucoup plus susceptibles de se casser.

L'agarose à bas point de fusion est utilisé pour des applications spécialisées, telles que la ligature en gel. Ces gels sont très "soupes" et fragiles, même à des pourcentages comparables, alors assurez-vous de prendre le bon réactif avant de mélanger un lot d'agarose.


EXPÉRIENCES D'EXTRACTION D'ADN ET D'ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL UTILISANT DES MATÉRIAUX DE TOUS LES JOURS

Afin de mener à bien ce projet, nous avons décidé de diviser d'abord la procédure en trois sections spécifiques, chacune devant être traitée individuellement. En faisant cela, vous constatez que les défis suivants sont présents. Ce sont : (i) l'extraction de l'ADN, (ii) l'électrophorèse sur gel de l'ADN et (iii) la visualisation de l'ADN.

Extraction d'ADN dans un cadre de recherche :
Dans un cadre de recherche conventionnel, la première étape de l'extraction de l'ADN consiste à ouvrir la membrane de la cellule en utilisant des moyens physiques ou chimiques. Les exemples incluent l'utilisation de la sonication (ondes sonores), l'équipement d'homogénéisation (mélangeur, presse française, mortier et pilon) ou l'utilisation sélective de détergent. Pour nous, l'exploration des détergents (ou savons) ou des étapes physiques (mortier et pilon) étaient les choix les plus évidents.

Une fois que la cellule/le tissu a été lysé, les étapes suivantes impliquent généralement une tentative de purification ou d'enrichissement de l'échantillon pour votre ADN (c'est-à-dire se débarrasser des autres substances). Cela peut être fait de plusieurs manières, dont beaucoup ne sont pas techniquement réalisables sous notre rubrique MacGyver. Cependant, un lysat cellulaire peut être facilement enrichi en ADN en utilisant de l'alcool pour précipiter sélectivement l'ADN, le formant pour qu'il s'agglutine en une entité semblable à une "morve". Par conséquent, nous avons décidé de nous concentrer sur l'extraction de l'ADN génomique car ce type d'échantillon fonctionne mieux sous le protocole de précipitation d'alcool et est également l'espèce d'ADN la plus abondante pour faciliter la visualisation aux étapes d'extraction et de gel.

Une préparation génomique est également intéressante d'un point de vue pédagogique. Un enseignant pourrait poser « pourquoi les gens veulent-ils obtenir de l'ADN génomique ? » - une question qui peut conduire à de nombreuses discussions concernant le clonage de nouveaux gènes, des organismes (Dolly the Sheep) ayant une source d'ADN à des fins d'empreintes digitales (CSI, médecine légale ), ou encore la préparation d'un échantillon pour le séquençage de l'ensemble du génome de l'organisme (Human Genome Project). Se concentrer sur l'ADN génomique permet également à un étudiant d'explorer des échantillons provenant de différentes sources, où il existe une possibilité raisonnable que les différences de taille du génome puissent être discernées. En prime, la précipitation de l'ADN sous la forme d'une « morve » ajoute un facteur « wow » supplémentaire à l'activité.

Extraction MacGyver de l'ADN :
Les réactifs et les matériaux pour cette partie de l'expérience sont assez simples. Ici, il faut trouver une source de tissu, une sorte de rupture physique, une solution d'eau/tampon propre, un savon et un alcool. De plus, un certain type de conteneur pour le faire sera nécessaire, de préférence un conteneur de nature transparente.

Source de tissu :
Bien que les caractéristiques chimiques de l'ADN isolé soient pratiquement identiques d'un organisme à l'autre, la cellule dans laquelle il est logé peut varier considérablement. Par conséquent, le choix du tissu est la variable la plus importante, mais sans doute le meilleur élément avec lequel un étudiant peut jouer. Nous avons essayé d'extraire l'ADN d'oignons, de pois cassés, de maïs, de levure, de germes de soja, de germe de blé, de kiwi, de banane et même de cellules de joues humaines, le tout avec plus ou moins de succès. Nous constatons que dans l'ensemble, un bon ADN peut être obtenu avec n'importe quel produit frais ou matière céréalière, tant que l'expérimentateur est prêt à jouer pour trouver des conditions optimales. Dans l'ensemble, cependant, nous recommandons les tissus d'oignon ou de banane comme les meilleures sources d'extraction d'ADN nécessitant peu d'entretien. Nous recommandons également le germe de blé, dans la mesure où il existe une procédure « rapide » qui fonctionne très bien. Enfin, l'ADN isolé des propres cellules de la joue d'un élève est une alternative intéressante, car il apporte un élément personnel à l'activité. Cependant, il convient de noter que l'isolement des cellules de la joue est moins fiable.

Étape physique :
Selon le tissu que vous utilisez, une étape physique peut être justifiée. Cela peut être aussi compliqué que de couper le tissu puis d'utiliser un mortier et un pilon, ou aussi mineur que de taper avec une baguette en bois. En général, le matériel végétal et les coupes de viande bénéficieraient d'une telle étape, car les plantes ont une paroi cellulaire résistante et la viande contient généralement des stries musculaires dures.

Solution tampon :
C'est le fluide dans lequel l'échantillon doit être immergé et, en tant que tel, il a simplement pour rôle de protéger votre ADN. Il existe de nombreux tampons de type MacGyver possibles que l'on peut utiliser pour la procédure d'extraction, qui fonctionnent tous en gros (voir Tableau 1). Il convient toutefois de noter que l'eau distillée ou en bouteille doit être utilisée. L'eau du robinet semble avoir un effet mineur sur la procédure d'extraction et est en fait très préjudiciable dans les étapes de gel suivantes décrites plus loin.

A : « Tampon salin »
Solution saline à 0,9 % (solution pour lentilles de contact)

B : « Tampon régulier »
1,5 g de sel de table (NaCl)
5,0 g de bicarbonate de soude (bicarbonate de sodium)
jusqu'à un volume final de 120 ml avec de l'eau

C : « Tampon acide »
1,5 g de sel de table (NaCl)
5,0 g de bicarbonate de soude (bicarbonate de sodium)
5 ml de vinaigre
jusqu'à un volume final de 120 ml avec de l'eau

D : « Tampon de protéinase »
1,5 g de sel de table
5,0 g de bicarbonate de soude
Solution oculaire complète 2,5 ml ou 2 comprimés de protéines (marque Complete)
jusqu'à un volume final de 120 ml avec de l'eau

E : « Tampon pour attendrisseur de viande »
100 ml d'eau chaude
attendrisseur de viande 3g

*Notez que l'eau seule peut également être utilisée efficacement.

Savon/détergent :
Du savon à vaisselle liquide était généralement utilisé. En termes de détails, nous avons trouvé de meilleurs résultats lorsque le savon était incolore, et avons constaté que les versions non parfumées peuvent fonctionner mieux dans l'ensemble. Essentiellement, la plupart des savons disponibles dans les épiceries contiennent des additifs qui jouent un rôle dans la conservation, l'odeur, la couleur, l'élimination des taches, etc. Bien que ces choses ne soient généralement pas un problème avec la technique, choisir le savon le plus simple est une bonne chose à résoudre si vous n'avez pas de succès avec votre extraction. En général, nous avons constaté que l'utilisation d'environ 5 ml (ou moins) de détergent par 120 ml de solution fonctionne bien.

Filtration:
En fonction de votre choix de tissu et également de la quantité de tissu que vous avez décidé d'utiliser, il peut être pertinent d'inclure une étape de filtrage pour éliminer les débris. Cela permet une meilleure visualisation de l'effet de morve de l'ADN à la fin. Le filtrage peut être facilement réalisé à l'aide de filtres à café ou d'une étamine. Notez que lorsque vous utilisez une étamine, vous aurez besoin d'utiliser 3 à 4 couches d'étamine. Les filtres à café sont généralement plus faciles car ils sont moins chers, plus accessibles et plus faciles à nettoyer.

Précipitations avec de l'alcool :
La précipitation de l'ADN se fait par contact avec de l'alcool. Cet alcool est disponible en pharmacie sous forme d'alcool à friction de la variété iso-propanol à 99 %. Alternativement, la plupart des écoles auront accès à des stocks d'éthanol à 95 %. L'alcool doit être ajouté en couches afin que l'on puisse voir l'ADN se former à l'interface entre votre échantillon et l'alcool. Vous devez ajouter au moins deux fois le volume de votre échantillon original. Si vous ne voyez pas de "morve" se former, alors mélanger le tout devrait obtenir l'effet souhaité. Notez que si vous avez l'intention de recourir au mixage, l'étape de filtrage peut être particulièrement nécessaire pour faciliter la visualisation.

L'ADN précipite sous traitement à l'alcool car il est naturellement hydrophobe et, en tant que tel, aura tendance à s'agglomérer si le solvant n'est pas optimal (c'est-à-dire l'eau). En conséquence, l'ajout d'un alcool à votre préparation signifie que l'ADN n'est pas complètement solvaté dans son environnement optimal (l'eau) et qu'il s'agrègera donc et précipitera hors de la solution. Il convient de souligner que le degré et la facilité d'agglutination dépendront de la quantité d'ADN présent, ainsi que de la concentration à laquelle il existe. Par conséquent, si vous voyez des quantités minimales d'ADN, vous devriez pouvoir corriger cela en (i) essayant d'isoler davantage de tissus et (ii) resuspendant le matériau dans un plus petit volume de liquide.

TABLEAU 2 : PROTOCOLES SUGGÉRÉS D'EXTRACTION D'ADN GÉNOMIQUE MACGYVER :

PROTOCOLE GÉNÉRAL
1. Si nécessaire, découpez la source d'ADN de votre choix. Utilisez une quantité de la taille d'une fraise.
2. À l'aide d'un mortier et d'un pilon, broyer l'échantillon tout en ajoutant progressivement 10 ml de solution tampon préparée avec le détergent déjà ajouté. Broyez pendant au moins 5 minutes avec tout votre poids et votre force pour vous assurer de briser la membrane cellulaire et d'atteindre une consistance de soupe crémeuse. Si l'échantillon est trop épais après broyage, ajoutez plus de solution saline pour obtenir l'épaisseur optimale afin que la partie liquide de l'échantillon puisse passer à travers le filtre, tandis que le plus gros matériau cellulaire reste sur le filtre. Remarque : si l'échantillon d'ADN est congelé, il est considérablement plus facile à broyer.
3. Filtrez le jus de votre échantillon dans un petit bécher. Laissez la solution s'égoutter dans le bécher jusqu'à ce que tout le liquide ait traversé le filtre. Si cela prend trop de temps, pressez simplement tout le jus de l'échantillon à travers le filtre.
4. Ajouter 2 volumes (cela signifie environ deux fois le volume de l'échantillon présent) d'alcool glacé sur le côté du bécher avec une paille ou une pipette pasteur. Faites cette étape lentement pour permettre à l'alcool de former une couche au-dessus de la couche de jus. Lorsque vous laissez reposer le bécher, l'ADN devrait précipiter. Plus vous attendez, plus vous devriez voir d'ADN. Si vous ne voyez pas de précipitations, mélangez doucement le tout.
5. Les précipités d'ADN doivent ressembler à un fil de morve blanche translucide, à l'interface entre le jus et l'alcool. Après un temps considérable, l'ADN peut éventuellement flotter au sommet de la couche d'alcool.
6. Vous pouvez retirer l'ADN avec un bâton de popsicle en bois ou une tige de verre. L'ADN adhère bien au bois.

PROTOCOLE RAPIDE
1. Placez une cuillère à café ou moins de germe de blé dans votre tasse.
2. Ajoutez environ 10 ml d'eau distillée et écrasez doucement avec un bâtonnet de popsicle/une baguette pendant 1 minute.
3. Ajoutez ensuite une giclée de détergent à vaisselle et écrasez doucement avec un bâton de popsicle pendant 2 minutes.
4. Versez lentement de l'alcool sur toute la longueur du bâtonnet d'agitation, en superposant l'alcool sur l'eau.
5. Posez le récipient sur une table et recherchez l'ADN à l'interface entre l'alcool et l'eau.

PROTOCOLE DE CELLULE DE JOUE
1. Mesurez 10 ml de «tampon régulier (du tableau 1), versez le tampon dans la bouche et faites tourner autour des joues pendant environ 1 minute.
2. Recrachez l'eau dans un récipient, de préférence quelque chose de relativement étroit comme un tube à essai.
3. Versez un peu de savon liquide sur l'échantillon et mélangez bien avec un bâtonnet de popsicle. Si vous pouvez mélanger par inversion, faites-le doucement environ 20 fois.
4. Ajoutez lentement 10 ml d'alcool froid à l'échantillon et assurez-vous de le verser en biais le long du tube à essai de manière à former deux couches. Faites-le très doucement, avec une paille, etc. Il est important que les deux couches ne soient pas perturbées.
5. Attendez environ 10 minutes et l'ADN apparaîtra à flot sur la couche d'alcool.

Électrophorèse sur gel de l'ADN dans un cadre de recherche :
L'électrophorèse est un moyen de séparer des molécules en fonction de leur charge et de leur taille. Dans notre cas, nous voulons séparer différentes tailles de molécules d'ADN génomique obtenues à partir de fruits, de légumes et de levure. Généralement, des polymères polysaccharidiques tels que l'agarose ou l'acrylamide sont utilisés pour former les gels d'électrophorèse. Parce que l'ADN est chargé négativement, on peut le forcer à traverser le gel en appliquant un champ électrique dans le système. Normalement, cela est réalisé en utilisant un appareil de gel spécial conçu pour faciliter la production ou la coulée du «gel» ainsi que pour permettre à une plate-forme d'immerger le gel dans un tampon contenant des ions pour créer un champ électrique. Un tel appareil fonctionnera un minimum d'environ 500 $, et les blocs d'alimentation normalement utilisés pour fournir

80V de tension peuvent fonctionner dans une gamme de prix similaire. Par conséquent, cet aspect du projet MacGyver est sans doute axé sur les économies de coûts et se concentre principalement sur la recherche d'un substitut à l'agarose et sur les orientations pour la production d'un appareil à gel.

Électrophorèse sur gel MacGyver de l'ADN :
Matériau du gel :
L'agarose est un composant des algues et, en tant que tel, est une molécule purifiée raffinée dérivée d'un épaississant alimentaire commun connu sous le nom d'« Agar Agar ». qui d'ailleurs peut être facilement trouvé dans la plupart des magasins d'alimentation de style oriental. « Agar Agar » peut être acheté sous forme de flocons, de nouilles ou de poudre. Essayez de vous assurer qu'il ne contient pas d'ingrédients supplémentaires (tels que du glucose) car ces ingrédients peuvent interférer avec la formation de la matrice de gel. Pour fabriquer le gel, il est recommandé d'utiliser de l'« Agar Agar » sous forme de poudre plutôt que sous forme de flocons ou de nouilles. Les autres formes plus grandes ont tendance à nécessiter une découpe et un filtrage supplémentaire, ce qui est problématique et très salissant.

Tampon en cours d'exécution :
Vous devrez préparer un tampon de fonctionnement qui est nécessaire pour fabriquer le gel, et également requis comme fluide qui finira par immerger votre gel solidifié pour permettre au champ électrique d'être conduit. La recette du tampon d'exécution de Macgyver est la suivante :

– 0,05 g de NaCl (c'est l'ion principal)
– 2g de bicarbonate de soude (bicarbonate de sodium)
– porter à 1L avec de l'eau en bouteille distillée

pH à l'aide d'un kit de pH pour aquarium d'animalerie à environ pH 7,5. (nous avons utilisé un tampon alcalin fabriqué par Seqchem).

Appareil de gel :
Bien qu'une boîte de gel de qualité recherche soit coûteuse, il s'agit en fait d'un équipement relativement simple. Il s'agit essentiellement d'un grand récipient (appelons-le une chambre tampon) qui peut contenir du fluide, les extrémités opposées étant connectées à une source d'alimentation mettant en place un scénario d'électrode positive/négative. La chambre tampon doit pouvoir contenir facilement un récipient plus petit (appelons cela la chambre de coulée de gel) qui est utilisé pour fabriquer et maintenir le gel. De plus, la plus petite chambre de coulée de gel doit s'adapter de manière à se trouver au milieu entre les deux électrodes de la chambre tampon.

L'assemblage de cette boîte d'électrophorèse devrait être assez simple et même agréable pour ceux qui aiment "faire des choses". Nous avons inclus ici un guide de dessin animé (Figure 1) pour fabriquer ces deux chambres à partir d'articles en plastique courants (tupperware, porte-savon, etc.). Pour les connexions des électrodes, nous nous sommes limités à des vis en acier inoxydable (5 cm) et du fil en acier inoxydable (calibre 20), qui ont bien fonctionné. Cependant, un système d'électrodes plus élaboré serait facile à réaliser avec une visite dans une quincaillerie appropriée.

Comme alternative à l'utilisation de tupperware, nous avons également trouvé que Lego était extrêmement utile pour fabriquer sur mesure une chambre tampon pour s'adapter à votre chambre de coulée de gel. Notez que les chambres Lego devront être doublées d'un matériau étanche, mais récemment Glad a développé un nouveau matériau "Glad Press'N Seal" qui fonctionne parfaitement et est facile à manipuler.

Enfin, un « peigne : devra être réalisé. Il s'agit d'un engin qui permet de former de petits puits dans votre gel. Ici, nous avons trouvé les lego particulièrement utiles, mais dans une impasse, nous avons également fabriqué des peignes en découpant des morceaux de plastique ou en collant les dents d'un vrai peigne à cheveux.

FIGURE 1 : NOTES DE CONSTRUCTION DE LA BOÎTE DE GEL MACGYVER.

Préparation du gel :
En utilisant l'Agar Agar en poudre, vous souhaiterez faire un gel de 1,2 % à 1,5 % (p/v ou 1,2 g à 1,5 g pour 100 ml de tampon d'analyse). Dans un récipient séparé (un flacon par exemple), pesez la quantité requise d'"Agar Agar" et ajoutez la quantité requise de tampon de coulée (les quantités spécifiques seront dictées par la taille de votre installation de coulée de gel). Le flacon doit être suffisamment grand pour que la solution « Agar Agar » forme une couche de 2 cm à la base. Ceci est nécessaire pour assurer une grande surface en contact avec la plaque chauffante pour une fusion efficace. Il est recommandé d'utiliser une plaque chauffante et de continuer à agiter pour chauffer la solution d'agar uniformément. Une alternative consiste à utiliser un micro-ondes, mais avec cette méthode, il faut utiliser un faible niveau de chaleur à de courts intervalles tout en remuant fréquemment le mélange. Si cette procédure n'est pas effectuée avec soin, la solution débordera probablement et créera un grand désordre. Notez que si la solution "Agar Agar" n'est pas complètement dissoute, cela affectera grandement la mobilité de l'ADN lors de son passage à travers le gel. De plus, des morceaux de gélose non dissous seront colorés pendant la procédure de coloration, ce qui rendra difficile la visualisation des bandes d'ADN.

Remarque : certaines écoles ont accès à la « Agar » utilisée pour fabriquer des plaques bactériennes. Ce matériau fonctionne très bien dans les gels de coulée (bien mieux que "Agar Agar") Nous recommandons de faire un gel à 1% w/v à des fins de visualisation génomique.

Assurez-vous que vous avez scellé les extrémités ouvertes de votre chambre de gel de coulée avec du ruban adhésif ou un matériau similaire. Versez le mélange fondu dans votre chambre de gel de coulée. N'oubliez pas d'insérer également le « peigne » afin que la formation de puits puisse se produire. Il faudra environ 20 à 30 minutes à température ambiante pour que le gel se solidifie. Pendant ce temps ne pas déranger le gel. Le gel est assez délicat, soyez donc très prudent lorsque vous retirez le peigne avant de charger votre échantillon

Le gel doit être versé sur une épaisseur d'environ 0,5 cm à 1,0 cm. Des gels plus épais permettent de créer des puits plus profonds, permettant ainsi de charger un échantillon plus grand. Les gels plus fins devraient fonctionner plus rapidement. Notez que si le gel est trop fin, il peut flotter lorsqu'il est immergé. Essayez d'utiliser le gel dès que possible. Bien que vous puissiez l'envelopper dans une pellicule plastique et le conserver au réfrigérateur pendant la nuit, ils fonctionneront mieux lorsqu'ils sont utilisés frais.

Préparation de l'échantillon d'ADN :
Votre ADN de morve génomique peut être retiré à la fin de la procédure d'extraction à l'aide d'un bâtonnet en bois. L'ADN doit ensuite être plongé dans une solution d'alcool à 70 % qui facilite l'élimination des sels en excès. Ceci est très important pour une dissolution efficace ainsi qu'un fonctionnement efficace du gel. L'ADN peut ensuite être séché à l'air pendant environ 10 minutes pour évaporer l'alcool résiduel, puis délogé dans un petit volume de tampon courant (le plus petit sera le mieux, c'est-à-dire <0,5 ml). Il convient de noter que l'ADN génomique peut souvent prendre des jours pour se dissoudre correctement. Nous suggérons de laisser l'ADN se dissoudre pendant la nuit à température ambiante (si vous avez accès à une température allant jusqu'à 50 °C, c'est mieux). Soyez doux avec votre échantillon car le grand ADN génomique est très sujet au cisaillement. Une fois l'étape de dissolution nocturne terminée, considérez ceci comme votre échantillon d'ADN, qu'il soit dissous ou non.

Votre échantillon devra ensuite être traité avec un tampon de chargement. C'est essentiellement quelque chose qui rendra votre échantillon visqueux afin qu'il puisse effectivement « couler » dans vos puits pendant le chargement. Souvent, un tampon de chargement a également un colorant, qui se déplacera dans la même direction que l'ADN, et rend également le chargement du gel plus facile à voir.

Notre recette est la suivante :
– 0,5 ml de glycérol/glycérine (disponible au rayon pharmacie)
– 0,1 ml d'eau distillée
– plusieurs gouttes de colorant alimentaire rouge Club House (notez que le choix du colorant peut grandement affecter le résultat - nous n'avons pas eu beaucoup de succès à trouver quelque chose de bon ici, donc un dernier recours serait de l'utiliser sans colorant).

Ce tampon de chargement peut être utilisé comme 5X à 10X, ce qui signifie que pour 0,5 ml d'échantillon, vous devrez ajouter 0,05 à 0,1 ml de tampon de chargement. Mélangez soigneusement. Votre échantillon est maintenant prêt pour le gel.

Gel en cours d'exécution.
Placez votre gel solidifié (dans la chambre de coulée de gel) dans la plus grande chambre tampon. Ajouter un tampon de coulée jusqu'à ce que le gel soit immergé de telle sorte qu'il y ait au moins 3 mm de liquide au-dessus du gel. Keep in mind that the more fluid you add, the slower the gel will run.
To your wells, load as much sample (with loading buffer) as possible. This is probably best done with a plastic stir stick attached to some type of rubber bulb. Essentially you would like to assemble something that can deliver fluid through a small tube. Once all the samples have been loaded, you will want to connect the electrodes to a series of 9V batteries. Your DNA is negatively charged so you want to position the positive electrode at the end “away” from the wells. Basically, one battery will suffice but will be very very slow (overnight run scenario). 5 to 7 or them lined up in a series circuit should deliver a good amount of voltage. Note that when the gel is running, DO NOT stick your finger in the fluid. Depending on the number of batteries you use, as much as 100mAmps of current is delivered (enough to give you a small shock).

When the circuit is running, a good visual check is to see that bubbles are forming from the wire electrodes, and usually most visible at the positive end.

The optimal amount of time to run the gel is, frankly, something that is difficult to predict, as it depends on the size of your gel, the thickness of your gel, the amount of running buffer in the system, the amount of voltage applied, and even the wiring set-up used. Consequently, this is the one thing where you will definitely have to play around. However, with a 5 to 7 battery set-up, you will need at least a minimum of 1hour, and possibly more. In addition, if differentiating genomic preps is in order (i.e. different genome size), you may need to experiment further with run time to see this potential difference.

Visualizing DNA in a Research Setting:
Upon completion of electrophoresis, the location of the bands need to be visualized. A common way to detect the bands is to stain the gel with ethidium bromide, which fluoresces under ultraviolet light to view the DNA. Unfortunately, both ethidium bromide and ultraviolet light are hazardous (Ethidium is higly carcinogenic and UV light can burn a person’s eyes without proper safety measures) and are therefore, not ideal for use among high school students.

MacGyver Way to Visualize the DNA:
To visualize the DNA bands, the gel was stained in a Methylene Blue solution. Methylene Blue consists of the salt methylene blue chloride. In water, the salt disassociates into a positively charged methylene blue ion that is colored blue and a negatively charged chloride ion, which is colorless. This blue chromophore is then able to bind to the positively charged DNA in the gel. Methylene blue is a convenient stain to use in the lab because it is chemically safe, reusable, and detects the presence of more than 20ng DNA/band.

More importantly, methylene blue can conveniently be found at most pet stores. It is generally sold as an aquarium disinfectant at a 5% concentration. The best gel staining results were obtained immersing the finished gel in a 0.02% methylene blue (in distilled water) solution overnight at room temperature. Using this protocol, destaining excess the excess colour with distilled water incubations was not required. We found that higher concentration solutions tended to stain the gel too dark making it difficult to differentiate the background from the DNA bands. This was observed even after destaining with distilled water. Also, if the “Agar Agar” powder was not completely dissolved in the gel, the non-dissolved flakes were stained dark blue, preventing the formation of distinct, visible bands.

FIGURE 2: CORN GENOMIC DNA PREP MACGYVER STYLE.


Yes, it’s faint! But it’s there…

Conclusion :
Overall, we have described an effective outline of methods to perform some basic molecular biology techniques under the MacGyver limitation (Figure 2). We should stress however that doing this in your own classroom will inevitably require some working out of your own. This is due to a multitude of considerations such as “Do I have enough DNA?” “what is my gel set-up” “what type of specialized reagents do I have at my disposal to make things even more efficient?” etc. However, it is hoped that the information presented here will make your troubleshooting as smooth as possible. Bonne chance!

Yas, Donna and Esther are at various stages of their careers in medicine or pharmaceutical studies. For the record, they have never ever worked together as a singing group.


Problem loading DNA / agarose gel - (Apr/21/2011 )

I had troubles when loading DNA into the wells of an agarose long gel. There is only enough buffer (TAE) on top of the gel to cover it, for quality purpose the gel isn't supposed to be soaked.
So I have DNA samples with loading dye, centrifuged to avoid any bubbles, no bubbles in the wells. The final volume of the sample is 18 L which is not too much for the wells (I'm pretty sure they could contain twice as much).
Sometimes when I load the sample I take out the pipette and 1 sec later the DNA goes out of the well as if it was "sucked up" and that makes the DNA in the next well spill out too!

I have no idea what's going on or what could be the cause of it. Could it be that there isn't enough buffer on top of the gel and the movement caused by the pipette induces the spilling?

thanks for any help, ideas, cunter-curses you could provide!

Did you make your own loading dye? Sometimes there is not enough or glycerol was not added at all into your loading dye which makes it "float" up.

I not sure how does the buffer have to do with the quality of the gel, and I don't understand why the gel was not soaked.

Dr_Watson on Thu Apr 21 15:45:43 2011 said:

I had troubles when loading DNA into the wells of an agarose long gel. There is only enough buffer (TAE) on top of the gel to cover it, for quality purpose the gel isn't supposed to be soaked.
So I have DNA samples with loading dye, centrifuged to avoid any bubbles, no bubbles in the wells. The final volume of the sample is 18 L which is not too much for the wells (I'm pretty sure they could contain twice as much).
Sometimes when I load the sample I take out the pipette and 1 sec later the DNA goes out of the well as if it was "sucked up" and that makes the DNA in the next well spill out too!

I have no idea what's going on or what could be the cause of it. Could it be that there isn't enough buffer on top of the gel and the movement caused by the pipette induces the spilling?

thanks for any help, ideas, cunter-curses you could provide!


Its hard to tell without seeing you do it.

A reason for example can be that you push down the pipette too much (further then the "first stop", like when you would want to empty the pipette completely).

Another problem could be that you just dont put the pipette deep enough.. another reason can be that you put it too deep and break the wells.
Or that you just dont use enough loading dye? BTW: you mention you centrifuge the samples with the loading dye, but when you use your pipette to place your sample in the gell, do pipette the sample up and down in the tube before placing it in the well? (to make sure the dye is spread nicely in the tube/trough the DNA ?


Have you tried it with a gell that is covered more (more buffer) and did you have the problem then? If not, then it might be that there isnt enough buffer and that the fluid just comes out because there isnt enough fluid covering your well (and what you put into it).

Sometimes it is attributed to remains of ethanol in the DNA sample. Perhaps you should try to dry the samples again or longer.

Did you make your own loading dye? Sometimes there is not enough or glycerol was not added at all into your loading dye which makes it "float" up.

I not sure how does the buffer have to do with the quality of the gel, and I don't understand why the gel was not soaked.

I didn't make the loading dye but know what's inside and there is glycerol. I have to add that I used that same loading dye several times before when doing regular small agarose gels, and never had a problem.
I have no idea about the buffer and the quality of the gel, but that's what my boss said and quite frankly he really doesn't like to be questioned so I just do it that way. I think he said it was the signal that's better or something. though I should try to soak it completely once just to check.

A reason for example can be that you push down the pipette too much (further then the "first stop", like when you would want to empty the pipette completely).

Another problem could be that you just dont put the pipette deep enough.. another reason can be that you put it too deep and break the wells.
Or that you just dont use enough loading dye? BTW: you mention you centrifuge the samples with the loading dye, but when you use your pipette to place your sample in the gell, do pipette the sample up and down in the tube before placing it in the well? (to make sure the dye is spread nicely in the tube/trough the DNA ?


Have you tried it with a gell that is covered more (more buffer) and did you have the problem then? If not, then it might be that there isnt enough buffer and that the fluid just comes out because there isnt enough fluid covering your well (and what you put into it).

hm good points and already thought about that (that is far from being the first gel I had to load )
so - I do not empty the pipette completely (afraid of any bubbles that could cause trouble), meaning I dont push further after the first stop.
- I try not to put the pipette too deep or it could provoke the kind of liquid movement I want to avoid. So I put it in the well but just at the top so it doesn't touch the sample that is at the bottom of the well.
- the loading dye being 6x, to 15 L of DNA I add 3 L of dye. I mix the dye to the DNA before centrifugation, mixing after that would defeat the purpose (avoid bubbles in the sample caused when you pipette up and down).

We are supposed to only put 100mL of buffer on top of the gel, I add more than 200mL I think last time I didn't have any loading problems when I added 300mL of buffer. but again when loading several wells on the same gel with samples prepared the same way, and loaded the same way, some will spill out others won't, even though once it starts spilling out all the buddys around just follow up.

dry again? they aren't dry in the first place. Just basic miniprep preparation using a kit so column. Same as always, and as I said before never had a problem with the small gels.

Dr_Watson on Thu Apr 21 16:38:14 2011 said:

- the loading dye being 6x, to 15µL of DNA I add 3µL of dye. I mix the dye to the DNA before centrifugation, mixing after that would defeat the purpose (avoid bubbles in the sample caused when you pipette up and down).

If you centrifuge it, your loading dye will be more at the bottom.
You can easly pipette the content of the tube up and down without it causing many bubbles.
If you do not do this, its possible that some amount (the upperpart of the tube) will get lost when pipetting it into the wells.
A good handling of the pipette can make you mix it without causing any bubble!

I dont know how you pipette the fluid out of your tube, put if you do it by sticking the pipette into the tube at the bottom , you will first suck up the heavier (with much loading DNA) content of the tube and the not so heavy will be sucked in as last and thus wil be put as first in the well.

If a not so heavy fluid is in a well and you push furrther down on your pipette to empty out the more heavier stuff, you can indeed lose the less heavy dna.. because it gets "pushed" up by the more heavy substance.
+ you will also lose a part of the loading dye because this is at the top of your pipette and will not be pushed into the well.. causing loss of DNA to (since the DNA has to be heavy enough (with the dye) to stay in the well. )

I know this sounds crazy and it will only play a minor role, but it does play a role.
I am nitpicking here.. but it could play a role.


Mixing the content of your tube is essential to have a good mixed DNA sample..

BTW: you centrifuge the sample, thus you must have seen this before: darkish blue at the bottom of the tube and more clearer at the top?

Anyway: this is nitpicking and also possible not important for you sine I dont know how long you vortex your sample. But if you do vortex it in such a way you see what I described about the darker blue at thebottom and the clearer at the top.. you should mix your samples before putting them on the gel. If not: you might lose DNA + see what you described: leaving of the clearer blue dye out of the wells because its pushed away by the more heavier darker blue dye).

To be honest with you Dr. Watson, I have never centrifuged my DNA samples before loading on a gel.

In the past, I ran my PCR, dropped the dye on a sheet of parafilm, then mixed the sample on the parafilm (if few samples), or dropped the dye directly into the PCR plate, then shoved it down into the sample using the multichannel & pipetted up and down a few times. Now I use GoGreen, which has the dye in it, instead of plain 5X buffer. You just pull the plate out of the thermal cycler and load the gel.

If the sample is forming a "plume" as you withdraw your pipette, try holding the pipette a little higher and not IN the well. If you're too deep, you are pushing the pipette against the bottom of the well, building up pressure as you dispense sample that can't exit the blocked tip, and causing the sample to jet out as you withdraw. If the there is sufficient glycerol in the sample, you can hold the tip above the well and it will drop straight down. If it floats out after loading, Pito and Dr. H's advice applies. Sometimes it helps to hover a microsecond longer to make sure all the sample has left the tip before withdrawing. Otherwise you could be trailing the very last of the sample as you move.

not crazy at all, at this point I'm open to any suggestions
So after centrifugation there aren't two phases, which as you said would mean that the dye is at the bottom and would need to be mixed. But I can't be 100% sure that it is well mixed. However, I had that problem before when mixing the dye to the DNA and without centrifugation.

Neither have I until two weeks ago. And because it was a suggestion made to resolve the spilling problem. Obviously it didn't help much.

So to resume, I should be careful about the dye being well mixed to the DNA, the pipetting and maybe add more buffer on top of the gel.

I'm going to check it out next week and will let you know if it helped.

thank you all for your replies and if you think of anything else, just let me know

have a happy easter, or Bonnes paques or whatever good weekend!!

keep the comb at least 2-3mm up from your gel tray. so that it not spread to other wells due to bubble or breaking of well due to tip

Smell your DNA and see if there is ethanol in it. That would be my first guess.


Agarose gel is edible.

Something I wrote for fun after a debate with someone in my lab.

Within the field of molecular biology, agarose gel electrophoresis is widely used to identify DNA by separation. But what happens with the gel after it is done? It’s photographed then promptly discarded. It’s a waste but what can we do to solve this problem? Agarose gel is similar in structure to gelatin and form, which is often eaten as a desert. In fact, agar, an unpurified mixture of agarose and agaropectin, is itself often used in food preparation similar to gelatin. Agar, purified from red seaweed, is often used as a vegan alternative to gelatin, which comes from animal cartilage.[1] Can the agarose gel used in agarose gel electrophoresis be repurposed into a tasty dessert with some flavoring and sugar? To answer this we must consider the safety of consuming all parts of agarose gel electrophoresis.

Agarose The agarose gel used electrophoresis is prepared from an agarose powder, which is agar agar without agaropectin. Agar agar is safe consume and widely used on cooking, so one assumes that a component of that should be safe as well. Agarose is a polysaccharide consisting of D-galactose and L-galactose, both of which can be metabolized by the human body.[2]

Tris Acetate EDTA (TAE) / Tris Borate EDTA (TBE) Buffer TAE and TBE are buffers used in both preparing the agarose gel and running electrophoresis. The materials safety data sheet for TAE lists possible concerns of “gastrointestinal irritation with nausea, vomiting and diarrhea” in the case of ingestion.[3] TBE buffer is worse than TAE, however, with its MSDS listing “irritation of the digestive tract,” “kidney damage,” and “central nervous system effects” as possible concerns.[4] While TAE and TBE are the most popular buffers for agarose gel electrophoresis, there exists others, including sodium borate, lithium acetate, and lithium boric acid, each with its own advantages and disadvantages, but we are primarily concerned with toxicity. Of these, sodium borate is the best to ingest, with no chronic health effects and only a slight hazard in case of ingestion.[5] Whenever sodium borate buffer is used in agarose gel electrophoresis, eating the agarose gel afterwards should be perfectly fine, while one only risks gastrointestinal irritation when using other buffers.

DNA/RNA The genetic material run in the agarose gel does not pose a any concern for health. Humans ingest it all the time when eating other animals or plants. What may be a concern, however, is RNA interference. RNAi has only been shown to affect humans in with extensive intravenous administration.[6] However, the safest thing to do is not eat any agarose gel that contains RNA meant to induce RNAi.

Fluorescent Dye Dyes are used to bind to DNA or RNA for visualization after agarose gel electrophoresis. Our primary concern is that these dyes can bind to human genetic material causing problems when ingested. Ethidium bromide, a popular dye, has been shown to be mutagenic. Safer commercial alternatives exist, such as SYBR Green and GelRed, that are less toxic. SYBR Green has been shown to much less mutagenic than ethidium bromide but is still a possible carcinogen.[7] However, it is has no immediate effect on the human body. With some flavoring added during the preparation of the gel, an agarose gel can be enjoyed after a hard day in the lab. I have shown that the components used in agarose gel electrophoresis are not immediately toxic and are only slight gastrointestinal irritants and a possible carcinogen, when ingested.

Ramaswamy K. (Jan 2012). How to Use Gelatin and Agar-Agar. Retrieved from http://honestcooking.com/how-to-cook-gelatin-agar-agar/ (accessed Feb 24, 2018)

Holden HM, Rayment I, Thoden JB. (Aug 2003). Structure and function of enzymes of the Leloir pathway for galactose metabolism. J. Biol Chem. 2003 Nov 7278(45):43885-8. Epub 2003 Aug 15. doi:10.1038/nature08956.

Tris Acetate EDTA, TAE MSDS [Online] Kerfast: Winston-Salem, NC. http://www.jtbaker.com/msds/englishhtml/a0338.htm (accessed Feb 24, 2018).

Tris Borate EDTA, TBE MSDS [Online] Kerfast: Winston-Salem, NC. https://www.kerafast.com/PDF/99%20TBE.pdf (accessed Feb 24, 2018).

Borate Buffer MSDS [Online] Sciencelab.com, Inc.: Houston, TX. http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9925528 (accessed Feb 24, 2018).

Davis ME, Zuckerman JE, Choi CH, et al. (April 2010). Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. La nature. 2010464(7291):1067–1070. doi:10.1038/nature08956.

Singer VL Lawlor TE Yue S (February 1999). "Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test)". Mutation research. 439 (1): 37–47. doi:10.1016/s1383-5718(98)00172-7


LAB 6: MOLECULAR BIO

Electrophoresis is the movement of charged particles in solution under the influence of an electric field. In gel electrophoresis, agarose gel is the stabilizing medium that serves as a matrix for the buffer in which the sample molecules travel. The gel is submerged in buffer within the electrophoretic gel cell. The samples are loaded into the sample wells in the gel, and electric current is passed through the gel.
Molecules of DNA are negatively charged because of negative charges on the phosphate group. In this exercise, nucleic acids migrate through the pores of the gel from the negative end of towards the positive end. The large DNA molecules move more slowly than smaller molecules, therefore molecules are sorted according to size.

Bacterial transformation occurs when a bacterial cell takes up foreign DNA and incorporates it into its own DNA. This transformation usually occurs within plasmids, which are small circular DNA molecules separate from its chromosome. There can be 10 to 200 copies of the same plasmid within a cell. These plasmids may replicate when the chromosome does, or they may replicate independently. Each plasmid contains from 1,000 to 200,000 base pairs. Certain plasmids, called R plasmids, carry the gene for resistance to antibiotics such as ampicillin, which is used in this lab.

Plasmids function in transformation in two different ways. They can transfer genes that occur naturally within them, or they can act as vectors for introducing foreign DNA. Restriction enzymes can be used to cut foreign DNA and insert it into the plasmid vectors. The bacteria used in this lab were Escherichia coli (E. coli). It was ideal for this transformation study because it can be easily grown in Luria broth or on agar, and it has a relatively small genome of about five million base pairs.

Transformation is not the only method of DNA transfer within bacteria. Conjugation is a DNA transfer that occurs between two bacterial cells. A bridge is formed between the two cells and genetic information is traded. In transduction, a virus is used to transfer foreign DNA into a bacterial cell.

1. Compare and contrast the number of colonies on each of the following pairs of plates. What does each pair of results tell you about the experiment?
LB+ and LB- Both of these plates had a lawn of bacteria. This proves that the bacteria are capable of growing on the agar and that there was nothing preventing growth beside the ampicillin.

LB/AMP- and LB/AMP+ The LB/AMP- had no growth, but the LB/AMP+ had small growth. This shows that the bacteria was transformed and developed a resistance to ampicillin.

LB/AMP+ and LB+ The LB/AMP+ had less growth than the LB+. This shows that the transformation was not completely effective and only transformed some of the most competent bacterial cells.

3. What factors might influence the transformation efficiency? Explain the effect of each you mention.
Transformation efficiency could be affected by the size of the colony added to the solution. In a larger colony the efficiency would increase because there would be more receptive cells. Another factor would b the amount of pAMP added. The more pAMP added, the higher the efficiency. The amount of Luria broth added could also affect efficiency. If the amount of Luria broth was increased, the efficiency would decrease

Discussion et conclusion:
The bacteria treated with the pAMP solution developed a resistance to ampicillin and were able to grow on the ampicillin+ plate. Those that were not treated with the pAMP were not able to grow on this medium. The plates with no ampicillin served as a control to show how the bacteria would look in normal conditions. Transformation is never fully effective, Only cells that are competent enough are able to take up the foreign DNA. Therefore, the ampicillin + plates showed less growth than the control plate.

Introduction:
Genes are transferred between bacteria by way of conjugation, transduction, or transformation. Conjugation takes place when the genetic material is transferred from one bacterium to another of a different mating type. Transduction requires the presence of a virus to act as a vector, or a carrier to transfer small pieces of the DNA from one bacterium to another. Transformation involves the transfer of genetic information into a cell by directly taking up the DNA. This lab uses transformation to insert a specific gene into a plasmid so that the cell takes on those characteristics for which the gene codes.

Plasmids are small rings of DNA that do carry genetic information. They can transfer genes, like genes for antibiotic resistance, which can occur naturally within them, or plasmids can act as carriers or vectors for introducing foreign DNA from other bacteria, plasmids, or even eukaryotes into recipient bacterial cells. Restriction endonucleases can be used to cut and insert pieces of foreign DNA into the plasmid vectors. If these plasmid vectors also carry genes for antibiotic resistance, transformed cells containing plasmids that carry the foreign DNA of interest in addition to the antibiotic resistance gene can be easily selected from other cells that do not carry the gene for antibiotic resistance. They are usually extrachromosomal. This means they exist separately from the chromosome. Some plasmids replicate only when the bacterial chromosome replicates, and usually exist only as single copies within the bacterial cell, but still others replicate on their own, autonomously. There can be anywhere from ten to two hundred copies within a single bacterial cell. There are specific plasmids called R plasmids that carry genes for resistance to antibiotics such as ampicillin, kanamycin, or tetracycline.

The bacterium Escherichia coli, or E. coli, is an ideal organism for the molecular geneticists to manipulate and has been used extensively in recombinant DNA research. It is a common inhabitant of the human colon and can easily be grown in suspension culture in a nutrient medium such as Luria broth, or in a petri dish of Luria broth mixed with agar, or nutrient agar. The single circular chromosome of E. coli contains about five million DNA base pairs, only one-six hundredth of the haploid amount of DNA in a human cell. Also, the E. coli cell may contain small plasmids, discussed earlier. The plasmids are broken up with calcium chloride, and the wanted gene is inserted and the bacteria can be grown on the nutrient or with an antibiotic to see if the gene has transformed the bacteria so that they are resistant to the antibiotics.

Compare and contrast the number of colonies on each of the following pairs of plates. What does each pair of results tell you about the experiment?

une. LB+ and LB- = These are two controls without the presence of ampicillin in the nutrient. They both had lawns of bacteria colonies on them because the E. coli grow naturally without the presence of the antibiotic.

b. LB/Amp- and LB/Amp+ = The LB on the ampicillin agar with the addition of the gene for transforming the plasmids of the E. coli should be able to survive, maintaining the characteristics of the gene present in their DNA. The LB should not have survived on the agar with ampicillin because this is how it would occur in nature, and there is no gene in the bacterium to help resist the antibiotic.

c. LB/Amp+ and LB+ = These two should both have growth. They both were exposed to the gene that protects E. coli bacteria against ampicillin and so they both should survive because it shouldn’t matter if the ampicillin is present or not. There is probably less growth on the ampicillin plate because not all of the bacteria cells could have transformed this would have only occurred under optimal conditions.

This lab shows the transformation of E. coli bacteria cells can affect the resistance those bacteria cells have to the antibiotic ampicillin. The transformation takes place when the plasmids of the bacteria are opened to taking in foreign DNA by the addition of calcium chloride, and they were finally accepted with the help of heat shock. The results show that if the bacteria cells were transformed, the cells could grow on the agar plates with ampicillin, now having a gene for resistance to that antibiotic.

Restriction enzymes are endonucleases that actually cut the phosphodiester bonds on the sides of deoxyribonucleic acid. These endonucleases recognize specific DNA sequences in double-stranded DNA, which is usually a four to six base pair sequence of nucleotides. The endonucleases then digest the DNA at these sites. The resulting product is usually fragments of DNA of various lengths. Some restriction enzymes cut cleanly through the DNA double helix while some produce uneven or sticky ends. By using the same restriction enzyme to cut DNA from different organisms, the sticky ends produced will be complementary and the DNA from the two different sources can be recombined. In humans, no two individuals have the exact same restriction enzyme pattern in the DNA except for identical twins. In DNA, the antiparallel strands are difficult to deal with considering the restriction enzymes cut from opposite directions. This is the reason for the complementary ends. The restriction enzymes are named according to a system of nomenclature. The first letter represents the genus name of the organism. The next two letters come from the species name. If there is a fourth letter, it stands for the strain of the organism. Finally, if there are Roman numerals, it represents whether that particular enzyme was the first or second etc. isolated in that category.
In the electrophoresis chamber, there is placed an agar gel. This gel has wells in it for the samples of DNA to go into. The agarose gel is covered in a buffer so that the DNA is in a neutral pH solution. That way, the DNA moves in the direction its charge forces it. Since the phosphate groups on the skeleton of DNA are negatively charged, the whole molecule takes on the negative charge. So, when the DNA is placed inside the gel and the electricity turned on so that the poles are drawing the DNA toward the positive side, it will move through the gel and separate according to the size of the fragments.

Hypothèse:
By way of electrophoresis, the fragments of DNA of lambda can be separated by the traveling of the fragments through agar gel according to fragment size DNA fingerprinting has occurred.

Des questions:
Discuss each of the following factors:

Voltage used. If a higher voltage had been used, the DNA would have moved faster through the agar gel, and slower if the voltage was low.

Running time. If allowed to run longer, the DNA would have eventually ended up into the running buffer, and lost to the experiment. If not allowed to run long enough, the bands could merge and be unclear for reading.

Amount of DNA. If more DNA had been used, the bands would have been darker because more of the fragments would have traveled the same distance in the gel. The bands would only have been more distinct and distinguishable.

Reversal of polarity. Had the polarity been reversed, the DNA would have been drawn the other way through the gel, and ended up in the running buffer.

Two small restriction fragments of nearly the same base-pair size appear as a single band, even when the sample is run to the very end of the gel. What could be dome to resolve the fragments? Why would it work? I would take the endonucleases needed to get the two fragment sizes and run an electrophoresis experiment just using those two sizes. It would probably work because these two fragments just by themselves can’t or shouldn’t stay together all the way to the end of the gel.

What is a plasmid? How are plasmids used in genetic engineering? Plasmids are small rings of DNA. They are used in genetic engineering because it is considerably easier to manipulate them into taking up preferred genes than it is to change the DNA sequence of the whole cell.

Que sont les enzymes de restriction ? Comment travaillent-ils? What are recognition sites? These enzymes are endonucleases that cut the phosphodiether bonds of the DNA. They only cut at specific proteins, the recognition site.

What is the source of restriction enzymes? What is their function in nature? They occur naturally in prokaryotes and are used to cut up invading viral DNA that happens to get through the cell wall and plasma membrane of the bacteria.

Describe the function of electricity and the agarose gel in electrophoresis. The electricity is used to pull the DNA in a certain direction so that it will separate. The gel is helpful because it is like a freeze frame that allows the fingerprinting to be visualized. This could not be done in liquid or any solid.

What are the functions of the loading dye in electrophoresis? How can DNA be prepared for visualization? The dye allows the DNA to be more distinct so that accurate measurements can be made in determining the distance traveled and the amount of bands.

Conclusion:
In conclusion, DNA fingerprinting, or electrophoresis is used to determine the size of the fragments that are cut by restriction enzymes. Restriction enzymes only cut at their specific protein recognition sites. This is useful because no two restriction enzymes code for exactly the same recognition site, allowing for a "fingerprint" like uniqueness that is only possible with one’s DNA. From the data collected in the electrophoresis experiment, other sizes of parts can be hypothesized by following the size of the base pair to the line of best fit drawn on the log sheet. This tells you about how many millimeters the base pair would probably go if allowed the same circumstances.


Loading and running the agarose gel

Load all the samples into the appropriate wells. Take care when pipetting to avoid stabbing the gel. It is best practise to pipette the samples out slowly to prevent them from coming back out of the wells.

Also, add a DNA ladder so you have a size reference when looking at your results. Select a DNA ladder with a large range of sizes which covers the size you are expecting in your samples.

Finally, add the lid onto the tank and connect it up to a power pack. Choose an appropriate voltage (V). A high voltage (e.g. 100 V) will migrate the samples through the gel faster than a slow voltage (e.g. 40 V). Don’t run the samples on too high a voltage (> 100V) as this can heat up the TBE buffer and cause the agarose gel to melt slightly. You also need to think about the size of the gel. Obviously, larger gels can run for much longer than shorter ones before your samples run off the end. Also, when using higher percentage gels, you will notice the migration of your samples is much slower compared to lower percentage gels.

I usually set my power pack to 60 V for about 60 – 90 mins. Whatever voltage you decide, be sure to keep on checking the gel to make sure you can still see the samples. Once the samples are near the bottom of the gel, you are good to stop the electrophoresis and inspect your gel using a UV transilluminator.


Voir la vidéo: Le chargement et La migration dADN sur gel dagarose (Février 2023).