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L'utilisation du knock-out CRISPR/Cas9 nécessite-t-elle l'ajout d'ADN de donneur dans le processus ?

L'utilisation du knock-out CRISPR/Cas9 nécessite-t-elle l'ajout d'ADN de donneur dans le processus ?


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Je suis nouveau dans cette technologie et je ne comprends pas très bien comment cela fonctionne. J'espère que quelqu'un pourra donner des suggestions ! Merci.


Réponse courte: Non, pour le knock-out CRISPR/Cas9, vous n'avez pas besoin d'ajouter l'ADN du donneur.

Un peu plus de détails : CRISPR/Cas9 vous permet de couper à une position donnée (définie par l'ARNg). Cela conduira à des cassures double brin (DSB).

Si vous n'ajoutez aucun ADN donneur, le mécanisme de réparation de l'ADN de la cellule essayer pour réparer la cassure double brin. Étant donné que ces DSB à médiation CRISPR/Cas9 ont généralement une extrémité émoussée, il est vraiment difficile pour le mécanisme de réparation de l'ADN de le réparer. Cela introduira souvent une erreur, par exemple en manquant une paire de bases (ou plusieurs) conduisant à une mutation par décalage du cadre de lecture. Ce mécanisme de réparation de l'ADN est appelé jonction d'extrémités non homologues.

Si vous ajoutez de l'ADN donneur, il contiendra à la fois la séquence que vous souhaitez introduire (disons une protéine fluorescente verte) et des séquences homologues des deux côtés de la cassure double brin. En d'autres termes, si vous voulez couper la séquence ATCGCA exactement au milieu, vous obtiendrez ATC et GCA. Vous voulez insérer AGA. Le plasmide donneur doit alors avoir la séquence ATCAGAGCA. Comme la cellule a maintenant les régions homologues, elle utilisera le mécanisme de réparation dirigée par homologie.

Les séquences ne sont données qu'à titre d'illustration - en réalité, un gène compte généralement plusieurs centaines de paires de bases et il est recommandé d'avoir des régions d'homologie beaucoup plus longues.


Frontières en sciences végétales

Cet article fait partie du sujet de recherche

Glycobiologie végétale - Un monde doux de glycanes, de glycoprotéines, de glycolipides et de protéines liant les glucides Voir les 31 articles

Édité par
Georg J. Seifert

Université des ressources naturelles et des sciences de la vie de Vienne, Autriche

Revu par
Jaime Barros

Université du nord du Texas, États-Unis

Haroon Fesses

Université des sciences et technologies du roi Abdallah, Arabie saoudite

Les affiliations de l'éditeur et des réviseurs sont les dernières fournies sur leurs profils de recherche Loop et peuvent ne pas refléter leur situation au moment de la révision.


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    Données associées

    L'édition du génome a refait surface en 2012 avec le développement de la technologie CRISPR/Cas9, qui est un outil de manipulation génétique dérivé du système de défense de certaines bactéries contre les virus et les plasmides. Cette méthode est facile à appliquer et a été utilisée dans une grande variété de modèles expérimentaux, y compris des lignées cellulaires, des animaux de laboratoire, des plantes et même dans des essais cliniques humains. Le système CRISPR/Cas9 consiste à diriger la nucléase Cas9 pour créer une cassure d'ADN double brin dirigée en utilisant une petite molécule d'ARN comme guide. Un processus qui permet une modification permanente de la séquence cible génomique peut réparer les dommages causés à l'ADN. Dans la présente étude, les principes de base du système CRISPR/Cas9 sont passés en revue, ainsi que les stratégies et modifications de l'enzyme Cas9 pour éliminer les coupures hors cible, et les différentes applications de CRISPR/Cas9 comme système de visualisation et activation ou suppression de l'expression génique. En outre, la revue met l'accent sur l'application potentielle de ce système dans le traitement de différentes maladies, telles que les maladies pulmonaires, gastro-intestinales, hématologiques, immunitaires, virales, auto-immunes et inflammatoires, et le cancer.


    Modification des gènes

    À la base, la thérapie par gain/perte de fonction génique comprend (1) la génération de cassures double brin (DSB) dans des régions définies du génome, (2) la correction des gènes endogènes défectueux ou l'introduction de gènes exogènes, et (3) Réparation DSB. Les DSB chez les eucaryotes sont réparés par l'un des deux mécanismes de réparation endogènes : la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) ou la réparation dirigée par homologie (HDR). Dans le NHEJ, les facteurs protéiques re-ligaturent le brin d'ADN rompu soit directement, soit en incluant des insertions ou des suppressions de nucléotides (indels) (Hefferin & Tomkinson, 2005). Ce processus se produit sans matrice d'ADN homologue, entraînant régulièrement des mutations et des suppressions dans le brin réparé (Bibikova etਊl., 2002), comme le montre la figure 1(A). Le NHEJ est donc caractérisé comme sujet aux erreurs. NHEJ peut se produire à n'importe quelle phase du cycle cellulaire et est le principal mécanisme de réparation cellulaire DSB. En revanche, HDR utilise un modèle de réparation homologue pour réparer avec précision le DSB (Capecchi, 1989 Takata etਊl., 1998) (voir Figure 1(B)). Le HDR se produit généralement à la fin du S- ou du G2-phase, quand une chromatide sœur peut servir de modèle de réparation. En général, l'incidence du HDR pour la réparation des DSB est extrêmement faible par rapport au NHEJ, du moins dans les cas où les deux voies sont également disponibles pour un organisme. Compte tenu de l'importante édition de gènes permise par HDR, le développement de méthodes pour augmenter l'incidence/l'efficacité de la HDR pour l'édition de gènes avec des nucléases spécifiques au site est un domaine de recherche actif.

    Après la formation d'une cassure double brin (DSB), la réparation de l'ADN endogène peut se produire par (A) une jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) entraînant des indels aléatoires, ou par (B) une réparation dirigée par homologie (HDR) qui utilise un ADN matrice brin pour une réparation précise.

    L'utilisation de nucléases spécifiques au site et de NHEJ ou HDR aboutit généralement à l'un des quatre produits d'édition de gènes. Représentés sur la figure 2, ceux-ci incluent l'inactivation, la suppression, la correction ou l'ajout de gènes. Le caractère sujet aux erreurs de NHEJ peut être exploité pour introduire des indels et des décalages de cadre dans les régions codantes d'un gène. Cela assomme le gène (figure 2 (A)) via une dégradation induite par un non-sens du transcrit d'ARNm. Dans la délétion de gène (figure 2(B)), des nucléases appariées excisent des régions du gène codant, entraînant une troncature prématurée et un knock-out de la protéine d'une manière plus généralement efficace que l'introduction de décalages de cadre. La correction de gènes (Figure 2(C)) et l'addition de gènes (Figure 2(D)) nécessitent une matrice d'ADN exogène qui peut être introduite sous forme de simple brin (Radecke etਊl., 2010 Chen etਊl., 2011 Soldner etਊl., 2011) ou ADN double brin (Rouet etਊl., 1994). La matrice d'ADN contient des bras de séquence homologues qui flanquent la région contenant la mutation ou la cassette de gène souhaitée.

    Produits d'édition de gènes basée sur des nucléases spécifiques au site : (A) knock-out de gène, (B) suppression de gène, (C) correction de gène et (D) ajout de gène.


    Éditeur de génome Invitrogen TrueDesign

    L'éditeur de génome Invitrogen TrueDesign est un outil en ligne gratuit qui permet aux scientifiques de tous niveaux d'expérience de concevoir, sélectionner et commander facilement des réactifs pour des expériences d'édition de gènes précises et réussies. Son interface intuitive de type pointer et taper facilite la recherche et la modification réussie d'un gène au cours d'un processus simplifié en trois étapes : recherche, modification et conception.

    L'outil TrueDesign prend en charge cinq types de modifications : knockout de gènes, marquage fluorescent, insertion, suppression et remplacement de SNP sur cinq espèces. Pour chaque conception, il compile une liste des matériaux dont vous aurez besoin pour une édition réussie, avec la commodité de les commander à partir d'une source et la certitude qu'ils fonctionneront ensemble. Notre recherche montre qu'une conception et une livraison améliorées de l'ARNg, de la nucléase Cas9 et de l'ADN du donneur peuvent contribuer à une édition améliorée du génome médiée par CRISPR/Cas9.[1]

    Conseil : Nous proposons également ARN guides synthétiques et lentiviraux préconçus pour un KO simple de votre gène cible humain ou murin, plus commande en ligne facile de toute conception sgRNA synthétique personnalisée.


    Créez un ADN de donneur prêt pour la transfection pour des expériences knock-in

    Présentation du kit d'ADN de donneur Invitrogen TrueTag, le moyen le plus rapide et le plus simple de créer de l'ADN de donneur pour des expériences de knock-in de gènes à l'aide de la technologie CRISPR-Cas9 ou TALEN. Le kit TrueTag Donor DNA maximise l'efficacité de l'édition et réduit considérablement le temps de protocole par rapport aux produits concurrents, car toutes les étapes de clonage ont été éliminées. TrueTag est le plus récent ajout à nos solutions complètes d'ingénierie cellulaire qui sont conçues pour fonctionner ensemble pour vous aider à obtenir des résultats précis avec moins d'effort. Le kit est livré avec tous les réactifs nécessaires pour préparer l'ADN du donneur et des protocoles faciles à suivre permettent de garantir que même les utilisateurs novices peuvent effectuer des knock-ins réussis dans votre propre laboratoire.

    • Jusqu'à 100 % de cellules modifiées-obtenir d'excellents résultats, quel que soit votre niveau d'expertise
    • Élimine les étapes de clonage-ajoutez simplement des apprêts et obtenez des résultats en quelques heures, pas en jours
    • Minimiser le temps de projection—sélectionner uniquement les cellules modifiées à l'aide de blasticidine ou de puromycine
    • Identifiez facilement les cellules modifiées-marquez votre gène sur l'extrémité N ou C avec GFP ou RFP

    4. DISCUSSION

    Ici, nous avons caractérisé l'efficacité de ciblage knock-out basée sur l'intégration dirigée par homologie-bras combinée avec le système CRISPR-Cas9. Deux ensembles de gènes ont été sélectionnés pour tester cette méthode. Les résultats ont montré que cette méthode basée sur le bras d'homologie a une efficacité de ciblage très élevée pour générer des clones de cellules knock-out, et tous les clones avec une mutation mono ou biallélique pourraient être utilisés pour l'analyse fonctionnelle.

    La stratégie normale pour créer une lignée cellulaire knock-out avec le système CRISPR-Cas9 est basée sur son mécanisme de jonction d'extrémité non homologue, qui conduit souvent à des INDELS lors de cassures double brin. Bien qu'il soit très pratique pour le clonage moléculaire préliminaire, il est long et laborieux pour le criblage de clones cellulaires ciblés positifs en raison de la variation de l'activité de l'ARNg et de l'environnement de localisation du génome ciblé. En revanche, l'insertion génomique basée sur le bras d'homologie peut être contrôlée avec précision. Afin de simplifier le processus de criblage après transfection, nous avons introduit une protéine de fluorescence et un marqueur de sélection de médicament au niveau de la cassette du donneur knock-in. Sur la base du tri des cellules FACS et de la sélection des médicaments, toute la procédure de génération de lignées cellulaires knock-out est moindre en trois semaines. En outre, l'efficacité de ciblage d'activation précise peut atteindre 70 % à la fois pour le ciblage à gène unique ou à gène double, ce qui indique que cette stratégie est très efficace (l'efficacité de ciblage est résumée dans le tableau 1). Pour cibler deux gènes simultanément, nous avons utilisé le même gène de résistance aux antibiotiques pour la sélection, il pourrait être envisagé que l'efficacité du ciblage pourrait être encore améliorée si deux gènes de sélection d'antibiotiques différents étaient introduits pour enrichir les clones de cellules de survie. Plus important encore, la cassette donneuse flanquée de deux loxP pourrait être retirée en option, ce qui offre plus de flexibilité.

    Gène/marqueur cible % Cellules positives pour la protéine fluorescente Nombre de clones résistants aux antibiotiques/96 cellules Numéro de clone analysé Numéro de clone ciblé
    Fut8 (EGFP) 17.4% 24 10 7
    Parvin+Escargot (EGFP+mCherry) 1.28% 10 10 7

    Dans des études antérieures, la longueur de bras d'homologie utilisée varie de 30 pb à plusieurs kilobases (kb) [ 18-20 ]. Et il a été montré que l'efficacité du ciblage augmente avec un bras d'homologie plus long [21]. Les bras d'homologie dans notre cassette conçue vont de 800 pb à 1 kb, et la cassette de gène de fluorescence et de résistance aux médicaments qui est établie dans notre laboratoire est d'environ 2,5 kb. Bien que nous puissions amplifier le bras d'homologie et cloner dans les deux extrémités de la cassette de sélection avec une méthode conventionnelle qui est rentable, cependant, cela peut prolonger toute la procédure en raison des étapes de clonage. De plus, le coût de la synthèse des gènes est bien moindre avec le développement des techniques de séquençage qui permettent aux chercheurs de raccourcir et d'accélérer le clonage moléculaire.

    Au cours de l'identification au niveau de la protéine, nous avons constaté que la protéine codée par le gène ciblé est également diminuée dans les clones cellulaires intégrés monoalléliques, ce qui indique qu'une autre copie du gène est également mutée. Et ce phénomène est également observé dans des recherches antérieures [ 7, 16 ] qui évitent le ciblage de second tour pour créer une mutation biallélique. Aleksandra et al adopté une méthodologie similaire pour l'édition du génome dans laquelle ils ont conçu une cassette de codage de gène de résistance aux antibiotiques sans promoteur avec des bras d'homologie flanquants aux deux extrémités [ 6 ]. Cependant, le niveau d'expression du marqueur de sélection doit dépendre du promoteur du gène endogène qui peut masquer l'efficacité du criblage si l'expression du gène dérivé du promoteur endogène est trop faible. Dans les clones de cellules doublement ciblées Parvin et Snail, nous avons constaté qu'un clone avec une mutation monoallélique présentait toujours une faible expression de la protéine Snail bien que le niveau soit faible. Puisque nous avons inséré la cassette du donneur dans le cadre avec la séquence protéique endogène, l'expression protéique restante peut être transcrite à partir d'une mutation indel dans le cadre.

    En résumé, le protocole que nous avons présenté ici pourrait faire gagner du temps et être très efficace pour étudier la fonction des gènes à l'aide d'une stratégie de knock-out basée sur le système CRISPR-Cas9. D'après nos études, des clones de cellules monoalléliques et bialléliques pourraient être utilisés pour des études fonctionnelles des gènes. De plus, la cassette insérée pourrait être retirée ou modifiée avec le système Cre-loxP qui offre aux chercheurs plus de flexibilité.


    Un de nos reporters a essayé de faire CRISPR. Il a lamentablement échoué

    Il y a plusieurs raisons pour lesquelles une coupe CRISPR mène plus facilement à un knock-out qu'à un knockin. Pour créer des knockins avec CRISPR, les chercheurs introduisent des étendues d'ADN «donneur», allant de quelques bases à un gène entier, conçues pour s'intégrer aux points de rupture créés par Cas9. L'épissage de l'ADN du donneur nécessite que ses extrémités correspondent ou soient « homologues » avec l'ADN endommagé. Un processus de réparation dirigée homologue (HDR) coud ensuite les extrémités ensemble.

    Le mécanisme de réparation knock-out, appelé jonction d'extrémités non homologues, peut se produire à n'importe quel stade du cycle de division cellulaire et se produit rapidement. Le HDR, en revanche, se produit principalement dans une phase du cycle cellulaire et est beaucoup plus lent. Certains gènes, tels que ceux sélectionnés par Jaenisch pour ses premières expériences de knockin, sont également plus propices au HDR que d'autres. « Le journal rapportait ce que nous avions trouvé », dit Jaenisch. "Maintenant, nous voyons qu'il y a des problèmes."

    Pour d'autres, les limites de CRISPR soulèvent des questions sur la décision du consortium de souris knock-out d'abandonner la technologie des cellules ES. Lancé en 2003, le projet a créé un référentiel de cellules ES mutantes, pour la plupart conditionnelles, pour près de 18 000 gènes. Tout chercheur peut commander une lignée cellulaire et passer un an ou plus à fabriquer une souris knock-out nécessaire. Il a également élevé 5011 souches de souris mutantes qui ont une transmission germinale du knock-out. Cet été, dans le cadre de KOMP2, le NIH a décidé d'étendre le décompte des KO en direct à 8000, en finançant JAX, l'Université de Californie, Davis et le Baylor College of Medicine à Houston, Texas, pour faire le travail. Mais il a précisé que les KO devaient être réalisés en utilisant uniquement CRISPR.

    Colin Fletcher, généticien de souris au National Human Genome Research Institute du NIH à Rockville, Maryland, qui supervise KOMP2, a déclaré que les conseillers avaient approuvé le passage à CRISPR. "Vous ne pouvez pas vous accrocher à l'ancienne technologie", dit Fletcher. «Beaucoup de gens ont abandonné le dépôt de cellules ES et, d'un autre côté, beaucoup de gens sont venus sur le terrain en raison de la nouvelle technologie. Les gens votent avec leurs pieds. Les gens font beaucoup plus d'efforts pour fabriquer des allèles conditionnels avec CRISPR plutôt que de fabriquer des cellules ES. »

    Skarnes, qui vient de passer de Wellcome à la branche de médecine génomique JAX à Farmington, Connecticut, appelle le changement prématuré. Mais il concède que les chercheurs trouveront "éventuellement" comment modifier CRISPR afin qu'il produise des souris mutantes conditionnelles avec une efficacité élevée. Une voie consiste à bloquer une enzyme cruciale pour la jonction d'extrémités non homologues. Une autre consiste à améliorer une protéine essentielle au processus HDR qui rend possible les knockins. D'autres chercheurs encore ont joué avec l'allongement de la phase du cycle cellulaire qui est la plus favorable à ce processus de réparation, en zappant des zygotes avec des impulsions électriques pour faciliter l'entrée de la construction CRISPR-Cas9 et en créant des Cas9 mutants appelés "nickases" qui ne cassent qu'un seul brin d'ADN et induisent préférentiellement HDR.

    Quelles que soient les lacunes de CRISPR à ce stade, Wiles souligne que son potentiel pour l'ingénierie des souris ne doit pas être sous-estimé. « Il y a un grand nombre de choses que CRISPR peut faire que les gens commencent tout juste à comprendre », dit-il. "Nous sommes vraiment aux toutes, très premières phases de développement et l'outil a des possibilités infinies."


    Publications

    Bras d'homologie de 1 ko. Ici, nous décrivons trois nouvelles façons plus simples de modifier les gènes chez les mouches. Nous créons des donneurs d'ADN simple brin (ADNsb) par PCR et ajoutons 100 nt d'homologie de chaque côté d'une cassette d'intégration, suivis de l'élimination enzymatique d'un brin. En utilisant cette méthode, nous avons généré des protéines marquées GFP qui marquent les organites dans les cellules S2. Nous décrivons ensuite deux méthodes d'ADNdb utilisant des donneurs synthétisés bon marché flanqués de bras d'homologie de 100 nt et de sites cibles d'ARNg clonés dans un plasmide. Lors de l'injection, l'ADN du donneur (1 à 5 kb) est libéré du plasmide par Cas9. La cassette s'intègre efficacement et précisément. L'approche est rapide, bon marché et évolutive.

    La façon dont les protéines contrôlent la biogenèse des gouttelettes lipidiques cellulaires (LD) est mal comprise. En utilisant la drosophile et des cellules humaines, nous montrons ici que la seipine, une protéine ER impliquée dans la biologie de la LD, médie une étape discrète dans la formation de la LD - la conversion de petites LD naissantes en LD plus grandes et matures. Seipin forme des foyers discrets et dynamiques dans le RE qui interagissent avec les LD naissants pour permettre leur croissance. En l'absence de seipin, de nombreuses petites LD naissantes s'accumulent près du RE et le plus souvent ne se développent pas. Ceux qui se développent acquièrent prématurément des enzymes de synthèse lipidique et subissent une expansion, conduisant finalement aux LD géantes caractéristiques d'une carence en seipine. Nos études identifient une étape discrète de la formation des LD, à savoir la conversion des LD naissantes en LD matures, et définissent un rôle moléculaire pour la seipine dans ce processus, très probablement en agissant sur les sites de contact ER-LD pour permettre le transfert de lipides vers les LD naissantes.


    Vecteurs GeneWeld pour une intégration ciblée à l'aide de CRISPR/Cas9 - #1000000154

    Chaque cercle correspond à une résistance spécifique aux antibiotiques dans les puits de la carte de la plaque du kit.

    Tableau consultable et triable de tous les plasmides du kit. La colonne Puits répertorie l'emplacement du puits de plasmide dans sa plaque. La colonne Plasmide renvoie à la page Web individuelle d'un plasmide.

    Carte de plaque à 96 puits pour la disposition des plasmides. Le survol d'un puits révèle le nom du plasmide, tandis qu'un clic sur un puits ouvre la page du plasmide.


    Voir la vidéo: CRISPR-CAS9 (Octobre 2022).