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1.4 : Effectuer une mutagenèse dirigée - Biologie

1.4 : Effectuer une mutagenèse dirigée - Biologie


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4.1 Objectif d'apprentissage

Dans ce laboratoire, vous effectuerez une mutagenèse dirigée à l'aide du kit de mutagenèse QuickChange (Stratagene). Vous apprendrez comment fonctionnent les polymérases et comment amplifier l'ADN à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR).

4.2 Organigramme du mini-projet

Le bloc en gras dans l'organigramme ci-dessous met en évidence le rôle de l'expérience actuelle dans le mini-projet.

4.3 Examen de la structure des acides nucléiques

Avant d'apprendre comment fonctionnent les polymérases et les exigences d'une amplification PCR réussie, vous devez revoir quelques éléments sur la structure des acides nucléiques. Acides nucléiques sont des polymères de nucléotides. Les nucléotides sont maintenus ensemble par des liaisons phosphodiester dans l'acide nucléique. La figure 4.1 montre la structure d'un nucléotide. Nucléotides sont constitués d'une fraction sucre : ribose (ARN) ou désoxyribose (ADN) ; une fraction aromatique hétérocyclique : la nucléobase (A, C, G, T ou U) et un groupement phosphate. Lorsque nous nous référons aux groupes fonctionnels au sein de la fraction sucre, nous utilisons le symbole de l'apostrophe ; par exemple, le deuxième groupe hydroxyle sur le ribose dans le nucléotide est appelé groupe 2'-OH.

Comme nous l'avons mentionné précédemment, les nucléotides sont maintenus ensemble par la liaison phosphodiester dans la chaîne d'acide nucléique. Les liaison phosphodiester est constitué de deux liaisons ester phosphate : chacune est formée entre un groupe OH du ribose ou du désoxyribose et un groupe OH du phosphate. Étant donné que l'acide phosphorique est un acide modérément fort, la liaison phosphodiester se déprotone dans des conditions physiologiques donnant aux acides nucléiques une charge négative (4.2.).

Les chaînes d'acides nucléiques ont polarité tout comme les chaînes de protéines. Les polymères d'acide nucléique commencent par le phosphate 5' du premier nucléotide et se terminent par le groupe 3'-OH du dernier nucléotide de la chaîne. La chaîne de l'acide nucléique a donc une direction précise ; il va de l'extrémité 5' à 3', tout comme les chaînes protéiques vont de l'extrémité N à l'extrémité C. Dans un acide nucléique double brin comme l'ADN (notre matériel génétique), un polymère d'ADN va de 5' à 3' et est appelé le brin supérieur et l'autre va de 3' à 5' direction est appelé le brin inférieur. Ces deux brins d'ADN sont complémentaires : l'adénine (A) contre la thymine (T) et la cytosine (C) contre la guanine (G) pour assurer un bon appariement des bases Watson-Crick entre les brins. En d'autres termes, les deux brins d'ADN de cet ADN double brin (dsDNA) sont complément l'un de l'autre. Complément signifie que les deux brins sont complémentaires et que le sens de la chaîne est opposé : le brin supérieur va de 5' à 3' tandis que le brin inférieur va de 3' à 5'.

5' AGGCCATTGGA 3'

3’ TCCGGTAACCT 5’

4.4 Comment fonctionnent les polymérases ?

Les polymérases synthétisent des acides nucléiques en utilisant une matrice d'acide nucléique. La séquence de l'acide nucléique nouvellement synthétisé sera complément de la séquence modèle. Au cours de la synthèse des acides nucléiques, le groupe 3'-OH de la chaîne nucléotidique en croissance agit comme un nucléophile pour attaquer le phosphore du nucléotide entrant, un pyrophosphate (PPje) feuilles et la liaison phosphodiester se forme. Cela signifie que la chaîne d'ADN nouvellement synthétisée croît dans le sens 5' vers 3' (4.3.).

Pour positionner correctement le nucléophile pour attaquer les ions métalliques divalents (généralement Mg2+) sont nécessaires à la réussite de la synthèse d'ADN.

Le mécanisme de la polymérase en bref:

– Les polymérases synthétisent l'ADN en utilisant une matrice qui est le complément de l'ADN nouvellement synthétisé.

– Pour synthétiser l'ADN, les polymérases ont besoin d'un groupe OH pour agir comme nucléophile. Cet OH provient de la chaîne d'acide nucléique en croissance. Reconnaître que la réaction est une substitution nucléophile.

– Le groupe partant est le pyrophosphate (PPje), qui est une molécule à haute énergie qui se divise en deux phosphates inorganiques. Cette réaction est catalysée par l'enzyme phosphatase inorganique in vivo.

– La polymérisation est énergétiquement favorable, car deux liaisons anhydride à haute énergie sont rompues (une dans le nucléotide triphosphate entrant et l'autre dans le pyrophosphate) et une liaison stable se forme (liaison ester reliant les nucléotides).

– Pour initier la synthèse d'ADN, les ADN polymérases nécessitent un apprêt pour fournir le groupe OH requis en tant que nucléophile.

- Les polymérases se déplacent de la direction 3' à 5' sur le brin inférieur de la matrice d'ADNdb pendant qu'elles synthétisent la chaîne en croissance dans la direction 5' à 3'.

4.5 Réaction en chaîne par polymérase (PCR) en pratique

Pour synthétiser l'ADN en laboratoire, nous devons effectuer une amplification par PCR de l'ADN d'intérêt en utilisant un vecteur plasmidique ou un ADN génomique comme matrice. Pour une amplification PCR réussie, nous devons parcourir trois étapes 25 à 30 fois. Les étapes de l'amplification PCR sont les suivantes :

  1. Séparation de la matrice d'ADNdb ou séparation des brins
  2. L'annelage des amorces à l'ADN matrice (elles forment des paires de bases Watson-Crick) pour initier la synthèse d'ADN
  3. Synthèse d'ADN catalysée par une polymérase

Une représentation graphique d'un cycle PCR est visible sur la figure 4.5.

4.6 Pourquoi la PCR n'est-elle devenue largement disponible que dans les années 1980 ?

L'amplification par PCR a nécessité deux avancées scientifiques. (1) Le scientifique a dû inventer une machine programmable qui peut faire défiler les températures du cycle PCR plusieurs fois. La machine PCR peut changer précisément et rapidement la température ; il peut passer de 95 ºC à 68 ºC en quelques secondes. (2) Les scientifiques devaient trouver une ADN polymérase capable de survivre à la première étape du cycle de PCR : l'incubation à 95 ºC. Cette étape est nécessaire pour séparer les brins de l'ADNdb. Puisque les polymérases sont des protéines, la plupart des polymérases bactériennes ou eucaryotes ne survivraient pas à cette incubation (pensez à ce qui se passe lorsque vous faites bouillir un œuf). Les scientifiques se sont tournés vers des organismes qui vivent dans des conditions extrêmes : dans des cheminées volcaniques à haute température. La plupart de ces organismes appartiennent au troisième règne de la vie - archée. Les polymérases de ces organismes ont évolué pour être actives à 60-80 ºC, donc une incubation à 95 ºC pendant quelques minutes ne leur fait pas de mal. Taq la polymérase a une demi-vie de 2 heures. à 95 °C pendant Pfu La turbo polymérase a une demi-vie de 19 heures. à 95°C. De plus, la polymérase utilisée pour la PCR doit être de haute fidélité - cela signifie que la polymérase incorpore très rarement un mauvais nucléotide dans l'ADN synthétisé (a un faible taux d'erreur). Taq la polymérase a un taux d'erreur de 16% dans une séquence d'ADN de 1 kilo de base tandis que Pfu Turbo la polymérase a un taux d'erreur de 2,6% sur la même séquence. Dans notre amplification PCR, vous utilisez une ADN polymérase d'Archaea Pyrococcus furiosus (Pfu Turbo).

4.7 Applications de la PCR

La PCR est utilisée pour amplifier l'ADN qui n'est présent qu'en quelques nombres de copies avec plusieurs ordres de grandeur. En conséquence, l'amplification PCR génère des millions de copies de la séquence d'ADN souhaitée. La PCR a révolutionné la biologie moléculaire et a une multitude d'applications au-delà de la science fondamentale. Quelques-unes de ces applications sont mises en évidence ci-dessous.

  1. Isolement spécifique de l'ADN : à l'aide d'amorces conçues pour le gène d'intérêt, une séquence d'ADN donnée peut être amplifiée. Cet ADN peut ensuite être inséré dans un vecteur de clonage pour une étude plus approfondie ou sa séquence peut être déterminée.
  2. Quantification de l'ADN (PCR quantitative en temps réel ou qRT-PCR). Cette méthode estime la quantité d'une séquence d'acide nucléique donnée présente dans l'échantillon. Étant donné que, théoriquement, chaque cycle de PCR double la quantité d'acide nucléique donné, moins il faut de cycles d'amplification pour générer une quantité détectable d'ADN, plus sa concentration était élevée dans l'échantillon d'origine. Cela signifie que les niveaux d'expression des gènes peuvent être déterminés. La méthode nécessite une amplification et une détection simultanées (en temps réel). Les amorces amplifient l'acide nucléique d'intérêt en présence d'un colorant fluorescent spécifique de l'ADN. Le nombre de cycles nécessaires pour obtenir des intensités de fluorescence détectables est quantifié (CT numéro). Ce nombre est inversement proportionnel à la concentration de l'acide nucléique cible dans l'échantillon.
  3. Cartographie des gènes. En utilisant des amorces spécifiques, une amplification d'un million de fois d'une partie donnée du génome peut être obtenue. De cette façon, même si seulement quelques nombres de copies de l'ADN donné sont disponibles, en utilisant la PCR, une quantité suffisante d'ADN peut être générée pour des études scientifiques. Cette caractéristique de la PCR a donné lieu à une multitude d'applications au-delà de la science fondamentale. Profilage ADN (empreintes génétiques) est une technique utilisée par les médecins légistes pour identifier un individu impliqué dans un crime ou déterminer la relation parent-enfant entre les individus (test de paternité). Même si 99,9% de la séquence du génome humain est partagée, il existe suffisamment de différences entre chaque humain pour permettre l'identification. Les procédures de test les plus couramment utilisées aujourd'hui se concentrent sur les répétitions en tandem courtes (STR). Ces régions du génome humain ont une séquence très variable, cela signifie qu'il est extrêmement improbable que des individus aient des séquences similaires à moins qu'ils ne soient étroitement liés. Seuls les jumeaux monozygotes, « jumeaux identiques », ont les mêmes courtes séquences répétées en tandem.
  4. PCR dans le diagnostic. En utilisant des amorces spécifiques sensibles à un agent pathogène donné (bactérie ou virus), la source d'infection peut être identifiée par PCR beaucoup plus rapidement qu'en cultivant des échantillons. De même, la cartographie de parties spécifiques du génome peut révéler si une personne est sujette au cancer du sein ou à d'autres maladies qui sont beaucoup plus traitables si elles sont détectées à un stade précoce.

PROCÉDURES

Les besoins en réactifs et équipements sont calculés par six équipes d'étudiants. Il y a environ 20% de franchise inclus.

Matériel/verrerie nécessaire :

  1. PCR
  2. Trois jeux de micropipettes 20-100 l, 2-20 l et 1-10 l
  3. 6 tubes PCR
  4. 6 tubes à centrifuger

Réactifs nécessaires

  1. Pfu Turbo polymérase master mix (Stratagene); 130 ul au total
  2. Enzyme de restriction DpnI (6 l au total)
  3. Amorces pour générer chaque mutant
  4. ADN plasmidique contenant le capteur de toxine ykkCD

Pour configurer la réaction PCR, mélangez soigneusement les réactifs suivants, placez les tubes dans la machine PCR et démarrez le protocole

  1. 20 l 2X Pfu Turbo Mastermix
  2. 100 ng d'ADN plasmidique (le volume dépend de la concentration d'ADN)
  3. 1 l 1 M d'apprêt supérieur
  4. 1 l 1 M d'apprêt de fond
  5. Eau à 40 l

La machine PCR est programmée comme suit :

Supprimer l'ADN matrice (ne contient pas la mutation)

  1. Retirer les réactions de la machine PCR et les centrifuger brièvement pour s'assurer que tout le mélange réactionnel se trouve au fond du tube.
  2. Ajouter 1 ul d'enzyme de restriction DpnI dans chaque tube.
  3. Incuber les réactions dans un bain-marie à 37 ° C pendant 1 heure.
  4. Les réactions peuvent être conservées à -20 °C jusqu'à utilisation.

Notes à l'instructeur

L'expérience du chapitre 4 est conçue pour effectuer une mutagenèse dirigée sur le Bacillus subtilis ARN capteur tétracycline ykkCD. Le protocole avec des modifications minimales pourrait être utilisé pour effectuer une mutagenèse dirigée sur n'importe quel acide nucléique. Utilisation d'une ADN polymérase haute fidélité, telle que Pfu Turbo, est essentiel pour le succès de l'expérience, mais un autre fournisseur ou emballage peut être utilisé. Les amorces ont été commandées auprès d'Integrated DNA Technologies et reconstituées dans 1 x TE (Tris-EDTA) à une concentration de 1 M. L'ADN plasmidique contenant l'ARN capteur ykkCD est disponible sur demande auprès des auteurs. Étant donné que cette réaction PCR prend environ deux heures, il est pratique de commencer la session de laboratoire en mettant en place les réactions PCR et en donnant une conférence pré-laboratoire pendant que les réactions sont en cours. Ce laboratoire s'adapte parfaitement à un long examen en raison du travail de laboratoire humide minimal et du long temps de réaction. Selon le temps alloué à la session de laboratoire, les réactions PCR peuvent devoir être supprimées par l'assistant d'enseignement ou l'instructeur.

Questions préliminaires pour la mutagenèse dirigée

Définir les termes suivants.

  1. Nucléotide

  2. Acide nucléique

  3. Inverse-complément

  4. Ci-dessous se trouve le brin inférieur d'un ADNdb. Quelle est la séquence du brin supérieur? Marquez les extrémités 3' et 5' de la séquence du brin supérieur.

    3’ AAGTTCAAGGC 5’

  5. Calculez comment vous mélangez votre réaction PCR si la concentration de votre ADN plasmidique est de 275 ng/μl (utilisez la section Protocole de votre document). Montre ton travail.

Mutagenèse dirigée

Aperçu du rapport de laboratoire et distribution des points

  1. Plusieurs phrases définissant le but/but de cette expérience (2 pts.).
  2. Décrivez brièvement la réaction de l'ADN polymérase. Pourquoi est-ce thermodynamiquement favorable (environ 5 phrases ; 4 pts.) ?
  3. Décrivez brièvement la mutagenèse dirigée sur site Quickchange (5-10 phrases; 5 pts.).
  4. Décrire le premier cycle d'une réaction PCR. Assurez-vous d'indiquer la température à laquelle chaque cycle a lieu. Expliquez brièvement pourquoi vous obtenez une amplification significative avec la PCR (4 pts.) ?
  5. Décrivez le premier cycle de Quickchange PCR. Expliquez brièvement pourquoi vous obtenez moins d'amplification avec Quickchange qu'avec la PCR normale (5 pts.).
  6. Feuille de calcul PCR (30 pts.).

Feuille de travail PCR

Structure de l'ADN :

1. (3 pts.) Dessinez la structure de pdApdCpdT. Marquez les extrémités 5' et 3' et encerclez chacune des liaisons phosphodiester de ce petit acide nucléique.

2. (3 pts.) Montrer l'appariement à liaison H entre l'adénine et sa base complémentaire.

3. (3 pts.) Une petite molécule d'ADN double brin est étudiée. Étant donné la séquence d'un brin d'ADN :
GGCTACATTCGGAA
écrire la séquence de l'autre brin d'ADN. (Rappelez-vous, les séquences sont écrites de 5' à 3' direction).

PCR standard :

4. (3 pts.) Pourquoi la PCR est-elle décrite comme une réaction « en chaîne » ?

5. (3 pts.) Expliquez pourquoi deux cycles de PCR sont nécessaires avant que le produit d'ADN souhaité ne soit fabriqué.

6. (3 pts.) En PCR, une quantité définie d'ADN polymérase est ajoutée au début et doit rester active pendant tous les cycles suivants. Cette exigence limite sévèrement les ADN polymérases qui peuvent être utilisées. Pourquoi cela est-il ainsi?

Synthèse d'ADN QuickChange :

7. (3 pts.) La mutagenèse dirigée permet aux scientifiques de spécifier exactement où les changements de base d'ADN (mutagenèse) se produiront. Comment le processus QuickChange nous permet-il de réaliser une « mutagenèse dirigée vers un site ? »

8. (3 pts.) La PCR standard permet une « amplification » du produit ADN. QuickChange permet-il le même type d'« amplification ? » Expliquer.

9. (3 pts.) La PCR standard nécessite qu'une amorce se lie au début de la séquence matrice d'ADN. En revanche, une amorce QuickChange n'a pas à se lier au début du modèle mais peut se lier n'importe où le long de sa séquence. Comment expliquez-vous cette différence ?

10. (3 pts.) La PCR standard peut être utilisée pour faire de nombreuses copies d'un gène nouvellement isolé. En revanche, QuickChange n'est utile que pour effectuer des changements de base dans une séquence d'ADN bien étudiée. En quoi le processus QuickChange est-il différent qui fait une telle différence dans la façon dont il est utilisé ?


Mutagenèse (technique de biologie moléculaire)

En biologie moléculaire, mutagenèse est une technique de laboratoire importante par laquelle les mutations de l'ADN sont délibérément conçues pour produire des bibliothèques de gènes mutants, de protéines, de souches de bactéries ou d'autres organismes génétiquement modifiés. Les divers constituants d'un gène, ainsi que ses éléments régulateurs et ses produits géniques, peuvent être mutés de sorte que le fonctionnement d'un locus, d'un processus ou d'un produit génétique puisse être examiné en détail. La mutation peut produire des protéines mutantes avec des propriétés intéressantes ou des fonctions améliorées ou nouvelles qui peuvent être d'une utilisation commerciale. Des souches mutantes peuvent également être produites qui ont une application pratique ou permettent d'étudier la base moléculaire d'une fonction cellulaire particulière.

De nombreuses méthodes de mutagenèse existent aujourd'hui. Initialement, le type de mutations induites artificiellement en laboratoire était entièrement aléatoire à l'aide de mécanismes tels que l'irradiation UV. La mutagenèse aléatoire ne peut pas cibler des régions ou des séquences spécifiques du génome. Cependant, avec le développement de la mutagenèse dirigée, des modifications plus spécifiques peuvent être apportées. Depuis 2013, le développement de la technologie CRISPR/Cas9, basée sur un système de défense virale procaryote, a permis l'édition ou la mutagenèse d'un génome in vivo. [1] La mutagenèse dirigée s'est avérée utile dans des situations où la mutagenèse aléatoire ne l'est pas. D'autres techniques de mutagenèse comprennent la mutagenèse combinatoire et insertionnelle. La mutagenèse qui n'est pas aléatoire peut être utilisée pour cloner l'ADN, [2] étudier les effets des mutagènes, [3] et concevoir des protéines. [4] Il a également des applications médicales telles que l'aide aux patients immunodéprimés, la recherche et le traitement de maladies telles que le VIH et les cancers, et la guérison de maladies telles que la bêta-thalassémie. [5]


Introduction

La mutagenèse dirigée, l'une des techniques les plus importantes de la biologie moléculaire, a été largement utilisée pour étudier les structures et les fonctions des acides nucléiques et des protéines, les mécanismes des maladies génétiques et l'effet de la modification du génome 1,2,3,4 . Bien que les mutations géniques, y compris la substitution ponctuelle, la suppression et l'insertion, puissent être obtenues par une variété de méthodes, la mutagenèse dirigée 5,6 médiée par la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est l'une des approches les plus puissantes pour générer des mutants génétiques in vitro. Jusqu'à présent, de nombreuses méthodes basées sur la PCR pour la mutagenèse dirigée ont été développées 5,6 parmi lesquelles, la mutagenèse dirigée par PCR par extension de chevauchement a d'abord été développée 7,8. Dans cette méthode, deux réactions PCR indépendantes sont effectuées, les produits PCR résultants sont utilisés pour une réaction PCR d'extension de chevauchement. Les produits de la réaction PCR d'extension de chevauchement sont finalement clonés dans des plasmides. Cependant, les inconvénients de cette méthode sont que la réaction d'extension de chevauchement échoue fréquemment, et la méthode est laborieuse. L'une des méthodes les plus simples pour la mutagenèse dirigée est la méthode basée sur la PCR avec une paire d'amorces complémentaires (un fragment d'ADN double brin), où les plasmides agissant comme matrices d'ADN pendant la PCR doivent être digérés par l'enzyme de restriction. DpnI avant transformation 9,10 . Cette méthode a été largement appliquée à la génération de mutants de gènes dans de nombreux laboratoires. Par exemple, le kit de mutagenèse dirigée sur site à changement rapide (Thermo Scientific), l'un des kits de mutagenèse dirigée le plus souvent utilisés, a été développé sur la base de cette méthode. Cependant, l'efficacité de la réaction PCR dans cette méthode est extrêmement faible en raison de la formation d'amorces-dimères, ce qui conduit souvent à l'échec de la mutagenèse. Pour surmonter cet inconvénient, les scientifiques ont développé une méthode améliorée utilisant une paire d'amorces partiellement complémentaires dans la réaction PCR 6,11. Bien que les amorces partiellement complémentaires réduisent la possibilité de former les dimères d'amorces pendant la PCR, des produits de PCR avec des extrémités homologues sont éventuellement produits dans la réaction (voir le résumé sur la figure 1C). A cette occasion, les mutants de gènes ne peuvent pas être obtenus en transformant directement des produits de PCR en bactéries après Dpn I digestion à moins que les produits de PCR ne soient purifiés et soumis à une ligation et transformation recombinaison.

Un résumé montrant les méthodes établies pour la mutagenèse dirigée par PCR. (UNE) Un diagramme pour la mutagenèse dirigée basée sur la PCR, la PCR par extension de chevauchement et le clonage de gènes. Dans cette méthode, deux réactions PCR sont d'abord effectuées avec la paire d'amorces CFP et MRP et la paire d'amorces MFP et CRP. Les produits de PCR sont purifiés et les produits de PCR résultants ont été utilisés pour une PCR d'extension de chevauchement avec la paire d'amorces CFP et CRP. Les produits de la PCR d'extension avec chevauchement ont été digérés avec des enzymes de restriction, et les fragments résultants ont été ligaturés avec les plasmides digérés avec les mêmes enzymes de restriction. CFP, amorce directe de clonage CRP, amorce inverse de clonage MFP, amorce directe de mutation MRP, amorce inverse de mutation. Les étoiles rouges dans les panneaux de gauche et de droite représentent des bases mutées. (B) Un diagramme pour la mutagenèse dirigée basée sur la PCR avec une paire d'amorces complémentaires (fragments d'ADN double brin), la digestion Dpn I et la transformation. (C) Un diagramme pour la mutagenèse dirigée basée sur la PCR avec une paire d'amorces partiellement complémentaires, la digestion Dpn I et la transformation (a) ou basée sur la PCR avec une paire de fragments d'ADN partiellement complémentaires, la ligature recombinée et la transformation (b). () Un diagramme pour la mutagenèse dirigée basée sur la PCR avec une paire d'amorces inverses, la phosphorylation, la ligature et la transformation. Les points bleus dans le panneau de gauche représentent les groupes phosphorylés. Les étoiles rouges dans A-D représentent des bases mutées.

Une méthode efficace pour éviter la formation des dimères d'amorces est que la PCR pour la mutagenèse dirigée est effectuée à l'aide d'une paire d'amorces inverses 12,13. Cette méthode a été confirmée pour être efficace pour la mutagenèse de petits plasmides 12,13. Cependant, cette méthode prend du temps car les produits PCR doivent être purifiés, phosphorylés et ligaturés avant la transformation. En outre, l'efficacité de la phosphorylation de l'ADN est généralement si faible que la mutagenèse dirigée ne réussit pas parfois, même si les réactions PCR sont efficaces. Outre les méthodes décrites ci-dessus, Edelheit et ses collègues ont rapporté une méthode médiée par PCR pour la mutagenèse dirigée, où deux réactions PCR indépendantes sont effectuées à l'aide d'amorces simples directes ou inverses. Les produits PCR résultants de chaque réaction sont combinés à 95℃, suivis d'un recuit à 37℃, d'une digestion avec Dpn I, et transformation avec des cellules bactériennes 14 . L'inconvénient de cette méthode est peut-être encore la faible efficacité pour la mutagenèse due aux amorces uniques utilisées dans les réactions PCR. Des études antérieures ont montré que la mutagenèse dirigée peut être complétée en combinant la PCR avec des techniques de recombinaison d'ADN 15,16,17,18 . Kitagawa et Abdulle ont rapporté une méthode de mutagenèse dirigée in vivo utilisant trois fragments de PCR et un système de recombinaison homologue 15 . Récemment, Trehan et ses collègues ont établi une méthode en une étape pour la mutagenèse dirigée utilisant un système bactérien exprimant une protéine de recombinaison virale et les produits dérivés de la PCR avec une paire d'amorces partiellement complémentaires 18 . Cependant, le système bactérien doit être préparé avant la mutagenèse.

Malgré la disponibilité de nombreuses méthodes de mutagenèse dirigée, la mutagenèse de grands plasmides reste difficile in vitro. Dans cette étude, nous avons développé une méthode efficace qui peut être appliquée à la mutagenèse dirigée de grands plasmides (SMLP). Nous montrons que la méthode SMLP est très efficace pour la mutagenèse des plasmides jusqu'à 17,3 kb et peut être utilisée pour générer des mutations de substitution, de suppression et d'insertion pour les grands et les petits plasmides.


INTRODUCTION

Après leur découverte initiale, les candidats-médicaments anticorps nécessitent généralement une ingénierie supplémentaire pour augmenter l'affinité de la cible ou améliorer un certain nombre d'autres caractéristiques associées à la développabilité thérapeutique (par exemple, l'immunogénicité, la stabilité, la solubilité) (1). Ceci est indépendant de la source d'origine de l'anticorps (c'est-à-dire des animaux immunisés, des bibliothèques recombinantes ou synthétiques) (2). Même avec un candidat principal pour commencer, l'espace potentiel de séquences protéiques à explorer et à optimiser pour tous les paramètres médicamenteux pertinents s'étend de manière astronomique. Par conséquent, l'ingénierie des anticorps est effectuée à haut débit par mutagenèse de bibliothèque et évolution dirigée à l'aide d'un criblage d'affichage de surface, notamment l'affichage de phages et de levures (3-6). A quelques exceptions près (7, 8), ces systèmes d'affichage expriment typiquement des protéines d'anticorps sous forme de fragments [par ex. variable de fragment à chaîne unique (scFv) et liaison à l'antigène de fragment (Fab)] et sans certaines modifications post-traductionnelles (c'est-à-dire glycosylation). Cependant, pour la production thérapeutique, les scFv et les Fab nécessitent une conversion en molécules d'IgG glycosylées de pleine longueur, ce qui conduit par conséquent à une phase d'optimisation finale consistant à évaluer et à modifier les candidats médicaments directement dans les cellules de mammifères. Cette étape est effectuée à faible débit en raison des défis associés à la génération de bibliothèques dans les systèmes de mammifères (c'est-à-dire l'incapacité à conserver et à répliquer de manière stable les plasmides).

Lors de la conception d'anticorps candidats, les bibliothèques sont souvent construites par mutagenèse par réaction en chaîne par polymérase (PCR) (par exemple, PCR sujette aux erreurs et mutagenèse dirigée avec des amorces dégénérées), suivie d'un clonage dans des plasmides d'expression, ce qui les rend compatibles pour le criblage par phage et affichage de levure . Avec la motivation de pouvoir cribler les anticorps dans leur contexte natif en tant qu'IgG de pleine longueur avec une glycosylation appropriée, des tentatives ont également été faites pour incorporer des bibliothèques dans des cellules de mammifères à l'aide d'un transfert de gène épisomique, viral ou transposon ( 9-11) . Cependant, par rapport au phage (>10 10 ) et à la levure (>10 7 ), ces systèmes d'affichage de mammifères sont considérablement contestés par la petite taille de la bibliothèque (∼10 4 variantes pour les bibliothèques intégrées au génome) et la polyclonalité (plusieurs variantes d'anticorps par cellule). Par conséquent, afin d'avoir vraiment une plate-forme compétitive pour l'ingénierie des anticorps de mammifères, une méthode alternative qui surmonte ces limitations est essentielle.

Avec les progrès rapides des technologies d'édition du génome, notamment le système CRISPR/Cas9 (Cas9), il est désormais possible d'effectuer facilement des modifications génomiques ciblées dans les cellules de mammifère (12). Alors que Cas9 est le plus largement utilisé pour le knock-out de gènes (via la jonction d'extrémités non homologues, NHEJ) ou le knock-in de gènes (via la réparation dirigée par homologie (HDR)), il permet également la génération de bibliothèques dans les cellules de mammifères. Par exemple, Cas9 a été utilisé pour promouvoir le HDR avec des modèles dégénérés, résultant en une bibliothèque de variantes génomiques qui a été appliquée à la fois aux régions codantes et non codantes, fournissant un aperçu de la régulation des gènes, de l'expression et même de la résistance aux médicaments (13, 14) . Dans une étude récente, Cas9 a également été utilisé pour intégrer une plate-forme d'atterrissage génomique contenant un site de recombinaison, ce qui a permis l'introduction d'une bibliothèque de variants transgéniques (15). Bien que ces études illustrent le potentiel d'intégration de bibliothèques dans des régions génomiques spécifiques de cellules de mammifères, la transfection de réactifs d'édition du génome combinée à de faibles efficacités HDR limitent l'évolutivité et la facilité d'utilisation nécessaires pour générer des bibliothèques capables d'explorer un espace de séquence de protéines suffisant, ce qui est crucial pour l'évolution dirigée et l'ingénierie des protéines.

Dans cette étude, nous avons établi la méthode de mutagenèse dirigée par homologie (HDM), qui repose sur le HDR à haute efficacité par Cas9 pour générer des bibliothèques de mutagenèse dirigée dans des cellules de mammifères. Nous utilisons comme plate-forme d'affichage d'anticorps de mammifères, une lignée cellulaire d'hybridomes récemment développée, où les régions variables d'anticorps peuvent être échangées par HDR piloté par Cas9, appelées hybridomes plug-and-(dis)play (PnP) (16). Une caractéristique essentielle de notre méthode HDM est qu'elle utilise des oligonucléotides simple brin (ssODN) comme matrice de donneur, qui, par rapport à l'ADN double brin, augmentent considérablement l'efficacité d'intégration HDR (17-19) et réduisent également les événements d'intégration hors cible ( 20, BioRxiv : https://doi.org/10.1101/178905). En utilisant un test de génotype-phénotype cellulaire, nous avons optimisé une série de paramètres, nous permettant d'atteindre une efficacité d'intégration HDR robuste de 15 à 35%, atteignant ainsi une amélioration de 35 fois. Ensuite, en commençant par un anticorps spécifique de l'antigène modèle, le lysozyme d'œuf de poule (HEL), nous introduisons une bibliothèque dans la chaîne lourde variable (VH) région déterminant la complémentarité 3 (CDRH3) en utilisant des modèles ssODN avec des régions de codons dégénérés NNK et NNB couramment utilisées (où N=A/C/G/T, K=G/T et B=C/G/T). Après HDM, nous effectuons un séquençage de nouvelle génération (NGS) sur l'ensemble du VH région pour évaluer quantitativement la diversité et la distribution des bibliothèques. Nous maximisons en outre l'efficacité des bibliothèques HDM en mettant en œuvre une séquence cible optimisée d'ARNg et en sélectionnant rationnellement des nucléotides dégénérés pour correspondre aux fréquences cibles d'acides aminés (a.a.) des régions CDRH3 trouvées dans le répertoire d'anticorps des cellules B murines naïves (21, 22). Avec HDM, nous avons pu atteindre une taille de bibliothèque de >10 5 variantes validées par NGS. Nous examinons ensuite cette bibliothèque pour la spécificité envers notre antigène modèle, ce qui a conduit à la récupération d'un nouveau variant avec un CDRH3 unique. Nous montrons également qu'en utilisant HDM pour générer des bibliothèques de saturation à travers le CDRH3, nous pourrions effectuer une évolution dirigée et une maturation d'affinité. Enfin, nous appliquons HDM à la méthode récemment établie de balayage mutationnel profond (DMS) (23, 24), qui nous a permis de déconstruire le paysage de séquences de liaison à l'antigène de nos anticorps spécifiques à l'antigène. Grâce à HDM, nous avons développé avec succès une méthode rapide et facile pour la génération de bibliothèques de mutagenèse dirigée dans des cellules de mammifères, ce qui représente une approche polyvalente pour l'ingénierie d'anticorps à haut débit.


Nucléases

Iii. Effet des substitutions d'acides aminés spécifiques au site.

Selon des études de mutagenèse spécifique au site, la substitution de Arg-87 par Cys ou Gly réduit V de >10 4 fois (6, 7). Peut-être de manière surprenante, la substitution conservatrice par Lys (R87K) entraîne une réduction de 105 fois de l'efficacité catalytique (22). D'autre part, la substitution de Glu-43 par Asp (E43D) réduit l'efficacité catalytique de 1400 fois, tandis que les mutations de charge neutre de Glu-43 (par Gin, Asn, Ala et Ser) entraînent environ un Réduction de 5000 fois de l'efficacité (23). En revanche, le double mutant (E43S + R87G) n'a qu'un V 10 6 fois inférieur à celui de l'enzyme de type sauvage. La raison de cette sensibilité imprévisible aux changements d'acides aminés est que les substitutions conservatrices ou non conservatrices entraînent apparemment des modifications structurelles non locales mineures mais significatives affectant la conformation active (24). Toutes les enzymes mutantes Glu-43 qui viennent d'être mentionnées présentent des stabilités thermiques plus élevées que la SNase de type sauvage.


La mutagenèse dirigée du régulateur transcriptionnel à détection de quorum SinR affecte la biosynthèse de la ménaquinone chez Bacillus subtilis

Fond: La ménaquinone (MK-7) est une vitamine K très précieuse2 produit par Bacillus subtilis. Des approches communes d'ingénierie métabolique statique pour promouvoir la production de MK-7 ont été étudiées précédemment. Cependant, ces approches ont provoqué une accumulation de substances toxiques et une réduction du rendement du produit. Par conséquent, la régulation dynamique par le système de détection de quorum (QS) est une méthode prometteuse pour atteindre un équilibre entre la synthèse du produit et la croissance cellulaire.

Résultats: Dans cette étude, le régulateur transcriptionnel QS SinR, qui joue simultanément un rôle important dans la formation de biofilm et la production de MK, a été sélectionné et ses mutants dirigés ont été construits. Parmi ces mutants, la souche knock-out sinR (KO-SinR) a augmenté la biomasse du biofilm de 2,8 fois par rapport au type sauvage. SinR quad a maximisé le rendement de MK-7 (102,56 ± 2,84 mg/L). Pour déchiffrer le mécanisme de la façon dont ce mutant régule la synthèse de MK-7 et pour trouver des régulateurs potentiels supplémentaires qui améliorent la synthèse de MK-7, RNA-seq a été utilisé pour analyser les changements d'expression dans le système QS, la formation de biofilm et la voie de synthèse de MK-7. Les résultats ont montré que les expressions de tapA, tasA et epsE étaient régulées à la hausse de 9,79, 0,95 et 4,42 fois, respectivement. Par conséquent, SinR quad a formé des biofilms plus ridés et plus lisses que le BS168. Les expressions régulées à la hausse de glpF, glpk et glpD dans cette morphologie de biofilm ont facilité le flux de glycérol à travers le biofilm. De plus, les déshydrogénases de NADH, en particulier sdhA, sdhB, sdhC et glpD, ont augmenté respectivement de 1,01, 3,93, 1,87 et 1,11. Les niveaux d'expression accrus des NADH déshydrogénases ont indiqué que davantage d'électrons étaient produits pour le système de transport d'électrons. Electrical hyperpolarization stimulated the synthesis of the electron transport chain components, such as cytochrome c and MK, to ensure the efficiency of electron transfer. Wrinkly and smooth biofilms formed a network of interconnected channels with a low resistance to liquid flow, which was beneficial for the uptake of glycerol, and facilitated the metabolic flux of four modules of the MK-7 synthesis pathway.

Conclusion : In this study, we report for the first time that SinR quad has significant effects on MK-7 synthesis by forming wrinkly and smooth biofilms, upregulating the expression level of most NADH dehydrogenases, and providing higher membrane potential to stimulate the accumulation of the components in the electron transport system.

Mots clés: Bacillus subtilis Menaquinone SinR Site-directed mutagenesis Transcriptional regulator.

Déclaration de conflit d'intérêts

The authors declare that there is no conflict of interests.

Les figures

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The schematic of construction of KO-SinR ( UNE ) and E97K, Y101L, W104K,…

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The morphological changes of the biofilm ( UNE ), the biofilm biomass (…

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Structure of SinR and the residues of E97, Y101, W104 and R105 (…

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The morphological changes of the biofilm ( UNE ), the biofilm biomass (…

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Summary of draft reads of samples by Illumina deep sequencing. UNE Global comparison…

Transcriptomics analysis of differences between…

Transcriptomics analysis of differences between BS168 and SinR quad . UNE Gene Ontology…

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Transcriptomics analysis of differences between BS168 and SinR quad . UNE Gene Ontology…

Changes in transcript abundance of…

Changes in transcript abundance of genes involved in quorum sensing (QS) system and…

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Changes in transcript abundance of genes involved in MK-7 metabolic pathway. The biosynthesis…

Schematic diagram of electron transfer…

Schematic diagram of electron transfer chain in B. subtilis . Electrons are extracted…

Schematic diagram of electron transfer…

Schematic diagram of electron transfer chain in B. subtilis . Electrons are extracted…


Méthodes

Animal work

St14 –/– , Prss8 –/– , and Prss8 zym/zym mice have been previously described [6, 41, 49]. All studies were littermate controlled to avoid genetic background differences from confounding data interpretation. Both males and females were used in the study.

Generation of keratin-5-matriptase zymogen-locked and catalytically inactive transgenic mice

Keratin-5-matriptase transgenic mice were generated by performing site-directed mutagenesis on the full-length 3.1-kb mouse matriptase cDNA (GenBank AF042822) inserted into the pBK5-vector, which contains the 5.2-kb bovine keratin-5 regulatory sequences, β-globin intron 2, and 3′-polyadenylation sequences [14], by using the QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Site-directed mutagenesis primers for generating zymogen-locked matriptase, mutating the arginine 614 to glutamine, were F: 5′-CCTTTACCAAACAGGCTCAAGTGGTTGGTGGC-3′, R: 5′- GCCACCAACCACTTGAGCCTGTTTGGTAAAGG-3′. Primers for generating catalytically inactive matriptase, mutating the serine 805 to alanine, were F: 5′- TCCTGCCAGGGTGACGCTGGTGGCCCCTTG-3′, R: 5′- CAAGGGGCCACCAGCGTCACCCTGGCAGGA-3′. The linearized vectors were microinjected into the male pronucleus of FVB/NJ zygotes, which were implanted into pseudopregnant mice. Transgenic lines were established and maintained in an FVB/NJ background in the hemizygous state. The transgenic mice were genotyped by PCR amplification of genomic DNA extracted from tail biopsies using the following primers: 5′-CGTGCTGGTTATTGTGCTGTCT-3′ and 5′-GCTACCCATGGTTTTGGCGGTC-3′ [14], followed by direct sequencing of the amplified DNA.

Generation of matriptase zymogen-locked knock-in mice

A custom ZFN was designed by Sigma Aldrich to cleave the murine St14 gene encoding matriptase. The ZFN bound the St14 gene 55 bp downstream from the desired point of mutation at the sequence 5′-GCCCTGGCAGGTGAGCCTCCacgccCTGGGCCAGGGCCACTTG-3′ (small letters indicate cleavage site). A 2000 bp DNA donor fragment identical to the genomic sequence of mouse St14, except for the desired di-nucleotide substitution, CGC to CAA, changing arginine 614 to glutamine, was purchased from Blue Heron Biotech (Bothell, WA) spanning 1000 bp upstream and 1000 bp downstream from the desired point mutation. The donor DNA also contained three synonymous base pair changes (shown in Fig. 2a) to minimize the cleavage of the donor DNA by the ZFN. The linearized donor DNA and ZFN mRNA were microinjected into the male pronucleus of FVB/NJ zygotes, which were implanted into pseudopregnant mice. The ensuing founders were screened for the introduction of the desired mutation using the primers WT F 5′-CTTTACCAAACAGGCTCGC-3′, MUT F 5′-CTTTACCAAACAGGCTCAA-3′, R WT + MUT 5′-CCATCACCCTGCTATAGTGC-3′. All founders positive for the insert were subsequently analyzed by direct sequencing by using primers located upstream of the DNA template and downstream of the di-nucleotide substitution to preclude PCR amplification of randomly inserted donor DNA. Three founders positive for the mutation were identified, two of which transmitted the edited St14 allele when mated to Black Swiss mice. Offspring were genotyped by PCR using primers 5′-GCACACCCAGTGGAGATCAGA-3′ and 5′-CCAGCCAGTCAGGAGAGATGA-3′, which amplify a 250 bp fragment centered around the dinucleotide substitution. The CGC to CAA mutation results in the loss of a Cac8I restriction site (GCN˅NGC) and the simultaneous generation of a SmlI restriction site (C˅TYRA˄G). For genotyping, 5 μL of PCR product was digested overnight to completion with restriction enzymes Cac8I or SmlI.

RT-PCR and quantitative real-time PCR analysis

Total skin RNA from newborn pups was homogenized using Precellys matrix beads and the Precellys 24 high-throughput tissue homogenizer (Bertin Technologies, Miami, FL) and then purified using the RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). cDNA was amplified by reverse transcription, followed by PCR amplification using the High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), as recommended by the manufacturer. To specifically detect transgenic keratin-5-matriptase mRNA transcripts, PCR was performed on cDNA using the matriptase exon 1-specific primer R 5′-GCTACCCATGGTTTTGGCGGTC-3′ and a primer complementary to exon 2 of the rabbit β-globin gene F 5′-CACGTGGATCCTGAGAACTTCAG-3′. Quantitative real-time PCR analysis of matriptase was performed with SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) according to the manufacturer’s instructions using the following primers: Total matriptase, 5′-AGATCTTTC TGGATGCGTATGAGA-3′ and 5′-GGACTTCATTGTACAGCAGCTTCA-3′ Transgenic matriptase, 5′-GCTACCCATGGTTTTGGCGGTC-3′ and 5′-CACGTGGATCCTGAGAACTTCAG-3′ (annealing temperature 60 °C, denaturation temperature 95 °C, extension temperature 72 °C, 40 cycles). Matriptase expression levels were normalized against S15 levels in each sample and amplified with the primers 5′-TTCCGCAAGTTCACCTACC-3′ and 5′-CGGGCCGGCCATGCTTTACG-3′.

Protein extraction from mouse tissue

Tissues were dissected, snap frozen on dry ice, and stored at −80 °C until homogenization in ice-cold lysis buffer containing 1% Triton X-100, 0.5% sodium-deoxycholate in phosphate-buffered saline (PBS) plus Proteinase Inhibitor Mixture (Sigma) and incubation on ice for 10 min. The lysates were centrifuged at 20,000 × g for 20 min at 4 °C to remove the tissue debris, and the supernatant was used for further analysis. The protein concentration was measured with the BCA assay (Pierce).

Western blot of skin from K5-matriptase transgenic mice

Samples were mixed with 4 × SDS sample buffer (NuPAGE, Invitrogen) containing 7% β-mercaptoethanol and boiled for 10 min. The proteins were separated on 4–12% BisTris NuPage gels and transferred to 0.2-μm pore size PVDF membranes (Invitrogen) blocked with 5% non-fat dry milk in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.05% Tween 20 (TBS-T) for 1 h at room temperature. The PVDF membranes were probed with primary antibodies diluted in 1% non-fat dry milk in TBS-T overnight at 4 °C. Antibodies used for mouse lysates were sheep anti-human matriptase (catalogue no. AF3946, R&D Systems) and mouse anti-human prostasin (catalogue no. 612173, BD Transduction Laboratories, San Jose, CA). α-tubulin antibodies were used as a loading control (catalogue no. 9099S, Cell Signaling, Beverly, MA). The next day, the membranes were washed three times for 5 min each in TBS-T and incubated for 1 h with alkaline phosphatase-conjugated secondary antibodies (Thermo Scientific). After three 5-min washes with TBS-T, the signal was developed using nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate solution (Pierce).

Simple Western size separation of proteins from St14 gene-edited mice

The Peggy Sue capillary electrophoresis system [40] (Protein Simple, Wallingford, CT, USA) was used to analyze matriptase and prostasin in lysates from newborn mice. Briefly, snap frozen skin, kidney, lung or intestines from newborn mice were lysed in T-PER lysis buffer with proteinase and phosphatase inhibitors (Pierce) as well as the serine protease inhibitor AEBSF to a final concentration of 0.5 mM (Sigma). The lysates were spun at 15,000 × g for 15 min at 4 °C and the supernatant was used for the analysis. A final concentration of 1 μg total protein per μL of sample was analyzed with the antibodies, sheep anti-human matriptase (catalogue no. 3946, R&D Systems), mouse-anti human prostasin (catalogue no. 612173, BD Transduction Laboratories), and β-actin as a loading control (catalogue no. ab6276-100, Abcam) according to the manufacturer’s instructions for size separation of proteins. Quantitative analysis of immunoreactive proteins was performed using the Compass Software, which automatically measures the luminescence signal as a function of the amount of protein present in the sample at a certain molecular mass. The software calculates the area under the curve as a measure of the amount of protein [40].

Immunohistochimie

Organs were collected from mice and fixed in 4% paraformaldehyde in PBS for 24 h, embedded into paraffin, and sectioned. Tissue sections were cleared with xylene-substitute (Safe Clear, Fisher Scientific), rehydrated in a graded series of alcohols, and boiled in Reduced pH Retrieval Buffer (Bethyl, Montgomery, TX) for 20 min for antigen retrieval. The sections were blocked for 1 h in PBS containing 10% horse serum and incubated at 4 °C overnight with sheep anti-human matriptase (catalogue no. AF3946, R&D Systems). The slides were washed three times in PBS and incubated at room temperature for 45 min with secondary antibodies, using Alexa Fluor 594-labeled donkey anti-sheep (Invitrogen) or a biotin-conjugated anti-mouse secondary antibody (1:1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) and a Vectastain ABC kit (Vector Laboratories) using 3,3-diaminobenzidine as the substrate (Sigma-Aldrich). The tissue sections were washed three times for 5 min with PBS and mounted with VectaShield Hard Set Mounting Medium (Vector Laboratories).

Measurement of stratum corneum and epidermal thickness

Epidermal thickness (excluding stratum corneum) and stratum corneum thickness were measured using the ScanScope software from Aperio. Measurements were made in the same 0.5–1 cm segment of dorsal skin and were calculated by averaging independent measurements per 100 μm skin specimen.

Transepidermal fluid loss assay

Transepidermal fluid loss assay was performed exactly as previously described [6, 7].

Intestinal epithelial permeability assay

A 22 mg/mL fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled dextran (average 4000 g/mol, Sigma) in PBS was instilled directly into the stomach of mice at a volume of 10 μL per g of body weight. Intillations were made using a 1.5-cm long, bulb-tipped gastric gavage needle (Roboz, Gaithersburg, MD) attached to a 1 mL syringe. After 3 h, blood was collected from the heart of freshly euthanized mice and clotted for 2 h at room temperature. Sera were then isolated via centrifugation at 800 × g for 10 min at room temperature, upon which the clear upper phase was transferred into a new tube. All samples were immediately stored at –80 °C until analysis. For the analysis, 50 μL of each sample was diluted 1:3 in PBS (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) and dispensed into a 96-well plate. The concentration of FITC-dextran was determined by reading the fluorescence at 535 nm after excitation at 485 nm using a Victor3V spectrophotometer (PerkinElmer, Waltham, MA).

Cutaneous wound repair

Full thickness incisional skin wounds (15 mm) were made in the interscapular dorsum. Healing was assessed by daily inspection of wounds by an investigator blinded to genotype, as described previously [66]. Macroscopic closure of the incisional interface was evaluated both visually and by palpation, and the wound was scored as healed when only a minimal residual defect, which resolved very slowly with time, was observed.

Cell culture and PAR-2 activation assay

HEK293 cells (ATCC, Manassas, VA) were grown in DMEM supplemented with 2 mM L-glutamine, 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin (Invitrogen) at 37 °C in an atmosphere of 5% CO2. Cells (250,000/well) were plated in 24-well poly-L-lysine-coated plates and grown for 24 h. Cells were co-transfected with pSRE-firefly luciferase (50 ng), pRL-Renilla luciferase (20 ng), pcDNA3.1 containing a full-length human protease-activated receptor (PAR)-2 cDNA (100 ng) (Missouri S&T cDNA Resource Center), pcDNA3.1 containing human matriptase (100 ng), matriptase locked in its zymogen form (R614Q) or catalytically inactive matriptase (S805A) [37], pcDNA3.1 containing human HAI-1 (100 ng), pIRES2-EGFP human prostasin (100 ng), or catalytically inactive prostasin (S238A) [37] as indicated in the individual experiments. Lipofectamine (Invitrogen) was used as the transfection agent according to the manufacturer’s instructions. The pSRE-firefly luciferase is a luciferase reporter gene under the control of a multimerized serum-response element. The transfection medium was changed at 18 and 48 h after transfection, and the cells were serum-starved overnight. Cells were lysed and luciferase activity was determined using the Dual-Luciferase assay kit (Promega) according to the manufacturer’s instructions. Luminescence was measured using a Wallac Victor2 1420 multilabel counter (PerkinElmer Life Sciences), and the serum-response element activity was determined as the ratio of firefly luciferase to Renilla luciferase light units.

Cleavage assay of PAR fusion proteins

PAR-1 knockout (F2r –/– ) lung fibroblasts (KOLF) [67] were grown in DMEM supplemented with antibiotics and 5% fetal bovine serum. Transfections were performed with the TransitLT1 transfection reagent (Euromedex) in complete medium. The cells were transfected with pcDNA3.1SEAP-PAR2 encoding a secreted AP-fused PAR-2 protein [24], full-length human matriptase cDNA in the pcDNA3.1 vector, or the mutants matriptase R614Q and matriptase S805A, in combination with full-length human prostasin cDNA or the catalytically inactive mutant prostasin S238A. For all transfections, pcDNA3.1HAI-1 was included to prohibit the constitutive activation of PAR-2 activation. Cells were used for experiments 48 h after transfection to determine the cleavage of the co-transfected substrate SEAP-PAR2. After washing the monolayer for 1 h with OptiMEM, cells were incubated for 4 h with vehicle only and medium was collected (fraction 1). Trypsin (10 nM for 20 min) was then used to release all surface exposed SEAP moieties (fraction 2). SEAP hydrolysis of para-nitrophenyl phosphate in fractions 1 and 2 was assessed at OD405. The ratio between SEAP hydrolysis in 4 h (fraction 1) and a trypsin strip (fraction 2) was determined for all conditions. It was then normalized to the OD405 ratio of cells co-transfected with the SEAP protein and empty vector.

Statistics and general methods

All analyses were performed and graphs generated using the Prism5 software (GraphPad Software Inc.) For comparison of two samples, Student’s t test a été utilisé. For multiple comparisons, one-way ANOVA was used with adjustment for multiple comparisons (non-parametric for the gavage study). Transepidermal fluid loss rates were analyzed by linear regression and wound healing by the log-rank test. All tests were two-tailed. Exact sample sizes (biological replicates) are indicated for each experiment.

Choice of sample size

Figure 1c–f: Large litters containing similar numbers of wildtype and transgenic mice were chosen for analysis. Replicated two times. Figure 2k: Sample size based on tissue available for analysis performed one time. Figures 5b and i, 6i and j: Sample size based on number of litters available for analysis performed one time. Figure 8a–c: Sample size based on variation observed in prior use of assays [24, 37] replicated three times.

Inclusion/exclusion criteria

Littermates of transgenic mice and wildtype controls were included. Mice were not excluded from the study.

Randomization of study

The study compared mice of different genotypes and cells transfected with different plasmids. Randomization is not applicable.

Aveuglant

Blinded as to genotype in Figs. 1k, 4a and i, 6i and j, 7b and c.

Justification of statistical test

Parametric tests were used when normal distribution and equal variance could be assumed. Non-parametric tests had sample sizes of more than 5.


DISCUSSION

Regardless of its pedagogical potential, site-directed mutagenesis is generally cost-prohibitive. At $18.87/reaction (Table I), running the QuikChange site-directed mutagenesis kit would cost over $1,200 for the 64 students enrolled in BICH 414. Although less expensive kits are available, they still represent a significant expense, and many of them are far more time-consuming. In any event, given the low success rate of any site-directed mutagenesis system for the inexperienced practitioner, such expenses hardly seem justified. Faux mutagenesis confronts this failure rate in a practical way by turning troubleshooting into the primary learning objective. Although the current schedule for BICH 414 does not provide an opportunity for students to repeat the experiment with their proposed controls, it would not be difficult logistically to include a “second attempt” in a teaching module dedicated to site-directed mutagenesis. In fact, by carefully manipulating the phenotypes that students receive, it should be possible to “nest” failures so that repeating the “mutagenesis” with the proper controls would reveal a second cause of failure that could not have been detected until the first failure was resolved. Although it is certainly true that students could just as easily troubleshoot failure in an authentic experiment, they could not do so as inexpensively, nor would they collectively face as broad a spectrum of potential troubleshooting scenarios as the instructor is able to provide through faux mutagenesis.

Some may object to this approach of teaching site-directed mutagenesis on the basis that pantomime is not science. In other words, merely going through the motions of a scientific technique is not sufficient to teach the skills that technique entails. To an extent, this objection is justified. This exercise, for instance, provides no means to evaluate the ability of students to handle perishable reagents, nor does it test their sterile technique. However, this exercise does not exist in a vacuum there are many other opportunities throughout the semester to develop these skills by working with authentic reagents and techniques (Fig. 1). In fact, students only work with faux reagents for two of the four class periods dedicated to site-directed mutagenesis. This amounts to less than 10% of the total course content. Furthermore, even if students are not using real reagents, they are practicing fundamental skills such as pipetting, setting up reactions, following protocols, etc.

Another objection commonly expressed is that students might discover the deception and resent partaking in a farce. Admittedly, great care is taken to make everything appear as authentic as possible, even to the extent of keeping teaching assistants in the dark about the true nature of the exercise, a task made easier by the fact that teaching assistants in our department generally only teach for one or two semesters and none of them have assisted with BICH 414 more than once. All “reagents” are aliquoted and labeled just as they are in every other exercise carried out during the semester, and they are treated no differently. “Perishable reagents” are stored in the refrigerator prior to being aliquoted and kept on ice throughout the exercise. For PCR, students are instructed to wear gloves and use filter pipette tips just as they would if they were working with real reagents. Titered bacterial strains are diluted with a non-ampicillin-resistant strain of bacteria that has been grown to mid-log phase to maintain the appearance of genuine competent cells. Because nothing appears out of the ordinary, it does not occur to students when the time comes to question why they are given a set of four prelabeled microcentrifuge tubes containing competent cells. In fact, they tend to welcome the organization of the whole affair. In 2 years of running the course, ∼120 students have gone through this exercise, and not one has ever expressed any suspicions about its authenticity. For all that planning, however, the primary objective of having students learn through confronting experimental failure would not be compromised through “exposure” of the exercise as a “fraud.” Indeed, if “discovered,” it would make an interesting exercise to have students use what they have learned up to that point to try and discover just where the “trick” must have occurred.

Faux mutagenesis represents a viable alternative to teach valuable troubleshooting skills in a way that works well with the logistics of coordinating large laboratory classes and that can fit seamlessly with established curricula. Although independent research projects could teach the same sorts of skills, large laboratory classes do not always lend themselves to such inquiry-based approaches. Moreover, laboratory curricula in many programs mandate the teaching of a fixed number of techniques and concepts. The open-ended research projects of inquiry-based laboratories, especially in large class settings, run the very real risk of not covering all of the mandated material. It should also be noted that even if site-directed mutagenesis is not a desired part of a laboratory curriculum, the concept of planned and controlled failure as a means of teaching troubleshooting skills is portable to other experimental techniques.

By shifting focus away from a technique that works to an exercise that forces students to confront failure, it has been possible to introduce an inexpensive, hands-on way to teach the concepts behind a fundamental, yet largely ignored, biochemical technique. The careful use of positive and negative controls challenges students to delve deeply into the minutiae of site-directed mutagenesis. All too often in undergraduate teaching laboratories, students are given canned protocols that have been optimized for success in inexperienced hands. This tends to program students to expect that science always works the first time through. Any failure is usually attributed to “operator error,” and students simply move on to the next exercise. Yet failure is a fact of life in research that students should be prepared to handle in a more sophisticated way than a simple shrug of the shoulders and a sheepish grin while muttering something about “messing up somewhere.” Students should at the very least learn that there are systematic approaches to discovering sources of error. Doing so not only helps to prepare them for “real research” but also helps them develop analytical thinking skills and internalize a much deeper understanding of the techniques they are using.

Flowchart of BICH 414. This diagram shows site-directed (faux) mutagenesis within the context of the entire course. Laboratory modules bounded by rectangles represent work done by students, whereas numbers in parentheses represent the number of class periods dedicated to each laboratory module. Although students are taught about induction and overexpression, it is not logistically possible within the current structure of the class to have students perform these tasks. Instead, induced bacterial cultures overexpressing either wild type or mutant (E41K) ribonuclease Sa are grown in advance by the instructor (indicated by the oval) and stored as frozen cell pellets until needed by students. In terms of material, this represents a break in continuity (broken arrows). There is, nevertheless, conceptual continuity between all laboratory modules. Furthermore, with the exception of the “results” from site-directed (faux) mutagenesis, students do carry material forward from one module to the next. For instance, DNA isolated in the plasmid purification module is used in site-directed mutagenesis and the enzyme prepared in the protein purification module is used for both enzyme kinetics and protein unfolding.

Flowchart of Faux Mutagenesis Exercise. Each day represents the 3-h time block each section meets. As stated in the text, the primer design element could easily be done as a take-home assignment. The same is true of the worksheet performed on day 4. Each circle represents a separate ampicillin/IPTG/X-gal plate. Question marks represent the fact that each group is given a different combination of bacterial cultures to plate in order to simulate failure at different points in the protocol (see Table II). It should be noted that students are not given the “expected results” bounded by the rectangle.

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TC MC Échantillon Négatif Conclusion Next Task
B B W 0 Everything worked as expected DNA sequencing to verify mutation
B B 0 0 Problem with primer and/or template Order new primer/prepare new template and repeat experiment
B 0 0 0 Problem with reagents and/or thermocycler Check thermocycler program/order new kit and repeat experiment
B W W 0 DpnI digest did not work properly/System overwhelmed with remaining wild type DNA Repeat DpnI digests and transformation
W W W 0 Problem with IPTG and/or X-gal Repeat transformation after preparing plate with fresh reagents
0 0 0 0 Problem with transformation Repeat transformation with fresh competent cells

INTRODUCTION

Numerous techniques have been developed to allow the introduction of site-directed mutations into cloned genes. These fall into two major categories: those based on primer extension on a plasmid template (such as the original Kunkel method), and a number of PCR-based methods [for review see ( 1, 2)].

Owing to their relative technical simplicity, the PCR-based site-directed mutagenesis approaches have proven highly popular ( 3 – 9). These techniques involve either DNA ligase-based circularization of inverse PCR products (with the desired mutations incorporated into the amplification primers) ( 4, 7, 9), or the use of multiple PCR products such as splicing overlap extension ( 10) and megaprimer approaches ( 3, 5, 6, 8, 11).

The inherent limitation of all current site-directed mutagenesis approaches is the background of non-mutated and/or incorrectly mutated clones. Typically, more than 50% of the clones will not contain the correct mutation making it necessary to sequence multiple clones each time a site-directed mutant is constructed ( 12 – 14).

For the PCR-based techniques, the primary causes of this background are (i) failure to completely remove the original, transformable, template, and (ii) the generation of incorrect, transformation-competent, fragments derived from PCR mis-priming events. While the original template can be removed by gel purification ( 4, 15, 16) or DpnI digestion ( 9, 14), the cloning of mis-primed DNA fragments is problematic. These fragments, which contain the origin of replication and selection regions (e.g. the ou Je and antibiotic resistance cassettes), are generally smaller than the desired PCR fragment and hence clone preferentially to the desired full-length product. Such fragments result in clones containing unwanted deletions within the gene of interest.

A rapid universal mutagenesis approach for sequence insertion, deletion and substitution with simple steps and high mutagenic efficiency would be very useful. In this paper, we describe a simple, highly efficient, robust PCR-based, ligase-independent mutagenesis approach to insert, delete and substitute nucleotide sequences at any position of a plasmid in a single reaction tube. This method avoids problems arising from template carryover and PCR mis-priming events. Furthermore, the experimental design can be adapted to automated high-throughput applications allowing mass generation and screening of mutants.


Kunkel mutagenesis (dUTP system mutagenesis)

A method to construct a site-specific mutated gene and to select it away from the wild-type. A strain of E. coli with only weak dUTPase activity has high levels of dUTP and consequently incorporates dUTP into a plasmid DNA in competition with dTTP. This plasmid is used in an in vitro system as a template for DNA synthesis with a primer into which the desired mutation has been incorporated. The duplex, containing the wild-type sequence with Us replacing Ts (U-DNA) complementary to a strand with the usual DNA bases and incorporating the mutation, is introduced into a wild-type bacterium that can remove the inappropriate bases from, and thus inactivate, the U-DNA strand and leave the mutated strand to be replicated.

If you know of any terms that have been omitted from this glossary that you feel would be useful to include, please send details to the Editorial Office at GenScript: order@genscript.com


Voir la vidéo: Education. Transgénèse, caractérisations moléculaires et biochimiques des transformants. (Décembre 2022).