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Dans les transferts western, les contrôles de chargement doivent-ils être des protéines en quantités égales dans chaque voie ?

Dans les transferts western, les contrôles de chargement doivent-ils être des protéines en quantités égales dans chaque voie ?


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J'ai récemment fait un Western Blot et je fais une analyse de données sur mes blots. J'étudie la protéine GSK3, qui est une phosphoprotéine.

J'ai marqué ma membrane contre la GSK3 active et la GSK3 inactive. J'ai également marqué la membrane contre la GSK3 totale. J'ai utilisé Ponceau S comme contrôle de chargement. De ma coloration Ponceau S, j'ai vu qu'il existe des variations dans les quantités de protéines chargées par piste. Il y a donc des variations dans les quantités de GSK3 total par voie (les intensités des bandes ne sont pas toutes égales).

Je me demande si les intensités de bande de la GSK3 totale ne sont pas cohérentes entre les voies, dans ce cas, l'utilisation de la GSK3 totale serait-elle un bon contrôle de chargement pour normaliser mes données ? J'ai lu pour le cas des phosphoprotéines, vous pouvez normaliser la protéine totale (en utilisant un anticorps qui reconnaît toutes les formes de la protéine d'intérêt).

J'ai lu que les contrôles de charge sont des protéines endogènes qui ne sont pas affectées par les conditions expérimentales et utilisées comme indicateur de la concentration de l'échantillon. Mais si les quantités totales de GSK3 varient entre les voies, comment cela peut-il être un bon contrôle de chargement ? De même, pourquoi de nombreux chercheurs utilisent-ils Ponceau S comme contrôle de chargement, si les intensités de bande entre les voies varient (si vous ne chargez pas des quantités égales d'échantillon) ?

En d'autres termes, pour qu'une protéine soit un contrôle de charge, doit-elle être en quantités égales pour tous vos échantillons/voies ?

Toutes les idées sont appréciées.


Les contrôles n'ont pas besoin d'être chargés en quantités égales par exemple, mais ils doivent être exprimés de manière relativement égale entre les voies. Ils ont besoin d'une expression égale, de sorte que les contrôles peuvent être utilisés pour normaliser les valeurs des protéines expérimentales.

Il est courant d'utiliser des gènes domestiques, tels que la bêta-actine, qui sont généralement exprimés de manière égale entre les traitements pour contrôler la charge. Il est important de s'assurer que les traitements n'affectent pas ces protéines.

Pour des exemples et des justifications, voir :

https://www.abcam.com/primary-antibodies/loading-control-guide

https://www.bio-rad-antibodies.com/western-blot-loading-controls-antibodies.html

https://www.labome.com/method/Loading-Controls-for-Western-Blots.html


Western Blot : Préparation de l'échantillon

Notre nouveau guide de poche contient un ensemble d'étapes pour vous aider dans votre conception expérimentale.

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7 conseils pour optimiser vos expériences de Western Blot

Le Western blot n'est pas une science exacte : obtenir immédiatement des résultats parfaits et prêts à être publiés n'est pas exactement la norme. Cependant, vous pouvez prendre certaines mesures pour affiner vos expériences de buvardage et vous assurer qu'elles prennent le meilleur départ possible. Ce processus de mise au point est connu sous le nom d'optimisation, et plusieurs étapes du protocole de Western blot peuvent y être soumises.

1. PAGE FDS

Vos expériences de transfert Western commencent bien avant que vous ne commenciez à travailler avec votre membrane. Nous pourrions remonter jusqu'à la préparation des échantillons, mais dans l'intérêt de l'espace, commençons par l'échantillon séparation. Avec cela, vous obtenez ce que vous avez mis dedans - sans un bon gel SDS-PAGE, vous n'obtiendrez pas une bonne membrane, et tout s'effondrera à partir de là. Si vous coulez vos propres gels, veillez à assurer l'uniformité de leur maquillage. Sélectionnez le bon pourcentage d'acrylamide (voir le protocole Western blot de Proteintech [PDF]). Évitez cet effet « souriant » du front de teinture en résistant à la tentation de faire fonctionner vos gels à des tensions élevées et de remplir les puits vides avec un volume équivalent de tampon d'échantillon 1x.

Surtout, chargez une quantité uniforme de protéines, déterminez la concentration en protéines par dosage et préparez-vous à réduire votre quantité de chargement si vous obtenez des taches « striées ». Le laboratoire de validation de Proteintech constate que 30 g de protéines par piste donnent généralement des bandes sans stries et bien séparées.

2. Membrane

Votre choix de membrane peut faire une énorme différence dans le résultat de vos expériences de transfert Western. Les deux principaux types de membranes sont le PVDF et la nitrocellulose, mais il existe désormais plusieurs versions de chacun sur le marché des consommables, dont par exemple les membranes optimisées pour l'immunodétection par fluorescence ou les protéines de bas poids moléculaire.

Le PVDF est apprécié pour sa ténacité, sa stabilité et sa résistance à la plupart des acides et des alcalis (ce qui signifie que c'est la membrane de choix pour ceux d'entre vous qui souhaitent décaper et re-sonder vos taches). Les membranes PVDF offrent également une meilleure rétention des protéines que la nitrocellulose.

Les membranes de nitrocellulose sont facilement bloquées et fournissent généralement des rapports signal/bruit élevés. Cependant, vous ne pourrez pas les décaper et les re-sonder, et faire également attention à la taille des pores de la membrane de nitrocellulose.

Enfin, un mot sur la tradition du laboratoire : n'ayez pas peur de changer de type de membrane à cause des normes de laboratoire. Essayer quelque chose de différent peut être la clé d'un Western Blot optimal.

3. Concentration d'anticorps

En supposant que vous ayez déployé les efforts nécessaires pour sélectionner votre anticorps, votre prochaine étape devrait consister à déterminer la concentration d'anticorps de travail optimale.

Le taux de liaison entre l'anticorps et l'antigène (la constante d'affinité) est affecté par leurs concentrations relatives en solution (entre autres variables, comme la température et le pH). Les quantités d'antigène sont généralement fixées en Western blot (c'est-à-dire que votre protéine est fixée à la membrane), vous devrez donc souvent ajuster la concentration d'anticorps pour obtenir de meilleurs blots. Faire cela de manière organisée - tester plusieurs dilutions d'anticorps tout en maintenant tous les autres paramètres constants - vous aidera à déterminer la concentration d'anticorps optimale pour vos expériences.

Cette étape est appelée titrage des anticorps et doit être effectuée chaque fois que vous utilisez un nouvel anticorps ou un ensemble de conditions expérimentales. Cela devrait également être fait si vous remarquez qu'un nouveau lot d'anticorps polyclonaux ne fonctionne pas de la même manière que le dernier.

Comment titrer un anticorps

De nombreuses entreprises fournissent des dilutions recommandées sur leurs fiches techniques d'anticorps, et ce sont généralement de bons chiffres approximatifs pour vous aider à démarrer, cependant, il est toujours conseillé de titrer les anticorps, car les conditions utilisées pour obtenir ces dilutions recommandées peuvent être très différentes de celles que vous ré utiliser. Si une fiche technique du produit suggère d'utiliser une dilution de 1:1000, essayez une série de 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000 et 1:4000.

En général, si vous encadrez la dilution recommandée avec un doublement et une moitié de celle-ci (et une dilution entre chacune d'entre elles), vous devriez être sur la bonne voie. S'il n'y a pas de dilution recommandée pour commencer, essayez 1 g/ml d'anticorps purifié comme point de départ (les concentrations doivent être sur la fiche technique) et partez de là. N'oubliez pas de garder tous les autres paramètres du protocole identiques, tels que le type d'échantillon, les temps d'incubation, les temps de lavage et les températures.

Une note sur les anticorps secondaires

Il se peut que vous deviez également essayer différentes concentrations d'anticorps secondaires, en particulier dans le cas de la détection par chimiluminescence. La concentration de l'anticorps secondaire marqué par HRP affecte directement l'apparence des bandes. Trop peu d'enzyme HRP entraînera un faible signal chimiluminescent et des bandes lumineuses ou manquantes. A l'inverse, une concentration trop élevée produira des bandes « grillées ». Ceci est causé par un épuisement rapide du substrat au centre des bandes. La durée d'incubation du réactif chimiluminescent fera également une différence (voir #6, Détection, ci-dessous).

4. Conditions de blocage

Divers tampons de blocage sont disponibles et tous ne fonctionnent pas dans toutes les situations. Il est important d'essayer plusieurs tampons de blocage pour chaque paire anticorps-antigène. N'oubliez pas que les tampons bloquants à base de lait contiennent des éléments tels que la biotine endogène, les glycoprotéines et les enzymes qui peuvent interférer avec le signal. Les tampons à base de lait, par exemple, contiennent des phosphatases actives qui saboteront votre détection des protéines phosphorylées dans ces cas, essayez des alternatives telles que les bloqueurs à base d'albumine de sérum bovin.

5. Lavage

Dans la plupart des cas, chaque fois que j'ai eu un signal de fond élevé, la révision des étapes de lavage lors du prochain passage s'est avérée utile. Habituellement, je l'ai fait en augmentant la concentration de Tween-20 de 0,05% à 0,1%. Vous pouvez également modifier l'intensité du lavage en utilisant l'une des tactiques suivantes : augmenter les temps et les volumes de lavage, effectuer des changements de tampon supplémentaires ou utiliser des détergents plus puissants (par exemple, SDS au lieu de Tween 20). N'en faites pas trop.

6. Détection

L'étape de détection fait partie intégrante de l'obtention d'un bon signal de Western blot. Il existe de nombreux réactifs chimiluminescents et des alternatives chimiluminescentes, telles que la détection fluorescente, il existe donc de nombreuses options si votre méthode de détection actuelle ne répond pas aux normes de laboratoire. Vous pouvez choisir des réactifs avec plus de sensibilité ou ceux qui produisent un signal plus durable, par exemple. Ce dernier choix augmentera considérablement la reproductibilité de vos blots.

À un niveau plus simple, la détection chimiluminescente peut être optimisée avec des temps d'exposition au film. C'est probablement l'étape d'optimisation la plus fréquemment effectuée, car elle est simple et rapide. Exposez toujours vos taches pour une plage de points de temps individuels (mais rappelez-vous qu'après environ 10 à 15 minutes, tout le substrat HRP sera utilisé). Votre choix de film fera également la différence. J'ai toujours trouvé que les films conçus spécifiquement pour la détection chimiluminescente, plutôt que n'importe quel film radiosensible standard, étaient le choix optimal.

7. Découpez une étape !

Il est logique que si vous avez moins d'étapes à effectuer, il y a moins d'étapes qui peuvent mal tourner avec votre expérience et il y a moins d'étapes à optimiser en premier lieu. Les progrès technologiques et les modifications simples des réactifs, tels que l'imagerie par fluorescence et les réactifs conjugués HRP, respectivement, peuvent aider ici.

Bien que les systèmes d'imagerie par fluorescence ne soient pas encore disponibles pour chaque laboratoire individuel, il peut y avoir des installations centrales ou centrales dans votre établissement qui offrent cette technologie. Un avantage immédiat des systèmes de détection basés sur la fluorescence est qu'ils permettent la détection de plus d'un anticorps simultanément, éliminant ainsi le besoin de décaper et de re-sonder vos blots. (Nous vous recommandons cependant vivement de ne pas effectuer vos premières tentatives de Western blot en utilisant plusieurs anticorps primaires dans la même incubation, en particulier si l'imagerie par fluorescence n'est pas disponible et que vous choisissez d'utiliser la détection par chimiluminescence. Si vous souhaitez le faire finalement, laissez-le jusqu'à ce que vous connaissiez beaucoup mieux vos protéines et vos anticorps.)

Alternativement, vous pouvez ignorer complètement la détection secondaire des anticorps primaires et rationaliser votre protocole de transfert Western, en utilisant des anticorps primaires conjugués à la HRP. Certes, ceux-ci ne sont pas disponibles pour toutes les cibles protéiques, mais ceux qui reconnaissent les contrôles de charge et les balises protéiques courants pourraient vous faire gagner beaucoup de temps et constituer un bon investissement. Proteintech en a plusieurs !

En résumé

Les principaux objectifs de l'optimisation sont d'augmenter le rapport signal/bruit de bandes spécifiques et de diminuer les bandes non spécifiques (si présentes). Certes, si vous choisissez d'optimiser toutes les variables ci-dessus, cela vous prendra un temps considérable cependant, même une ou deux modifications peuvent faire la différence et vous faire gagner du temps à long terme. Dans l'ensemble, je considère que l'optimisation est une entreprise extrêmement utile et une stratégie nécessaire si vous voulez obtenir des Western blots de qualité publication.


Western Blot : Quantification des Protéines

Après lyse des cellules, il est important de déterminer la concentration totale en protéines de l'échantillon. Une quantification précise de l'échantillon vous permettra de charger la bonne quantité de protéines dans chaque voie. Cela évite de surcharger la piste mais permet toujours une détection adéquate de la protéine d'intérêt. Une quantification appropriée est également essentielle lors de la réalisation de westerns semi-quantitatifs ou quantitatifs. Pour déterminer avec précision les quantités relatives d'expression de la protéine, la même quantité de protéine doit être chargée dans chaque voie.

Il existe plusieurs méthodes différentes pour quantifier la concentration en protéines dans les échantillons. Certains (par exemple la mesure de la teneur en azote ou le marquage radioactif des cellules) ne reposent pas sur les propriétés d'absorption de l'échantillon de protéine. Bien qu'il puisse s'agir d'analyses sensibles et précises, les analyses les plus couramment utilisées reposent sur la détermination spectrophotométrique de la concentration en protéines et elles seront au centre de ce guide.

Les méthodes spectrophotométriques pour mesurer la concentration en protéines sont des tests populaires. Ils sont généralement faciles à faciliter, sensibles et ne reposent pas sur l'utilisation d'agents dangereux. Il existe plusieurs méthodes et kits différents pour utiliser un spectrophotomètre afin de déterminer la concentration en protéines. Le choix de la meilleure méthode dépend de divers facteurs. Un test de quantification des protéines doit être facile à utiliser et ne pas être trop coûteux. La plage du dosage doit vous permettre de quantifier avec précision tous les échantillons de protéines. Généralement, une réponse linéaire sur une large plage est souhaitée. La sensibilité du dosage déterminera le niveau le plus bas de protéine pouvant être détecté. Les dosages ont également des spécificités différentes. Les composants tampons, tels que les détergents, peuvent interférer avec le dosage.

Les différentes capacités et limites de plusieurs tests sont discutées ci-dessous.

Absorbance à 280 nm

Une mesure rapide mais moins spécifique de la concentration en protéines est l'absorbance de l'échantillon à 280 nm. La plupart des protéines ont un maximum d'absorbance à 280 nm par opposition aux acides nucléiques qui absorbent à 260 nm. Les résidus aromatiques, tels que le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine sont responsables de l'absorbance observée, ainsi les protéines dépourvues de ces résidus ne peuvent pas être mesurées à l'aide de ce dosage. Nécessite environ 50 g pour des lectures précises.

Bien que la contamination par les acides nucléiques puisse interférer avec la mesure de la concentration en protéines à 280 nm, une mesure plus précise peut être prise en mesurant l'absorbance de l'échantillon à la fois à 260 nm et à 280 nm et en utilisant le calcul suivant :

Protéines mg/mL = 1,55 A280 – 0,76 A260

  • Bon pour les échantillons contenant une seule protéine d'absorptivité molaire connue
  • Utile en chromatographie pour déterminer le profil d'élution de la protéine
  • Dosage simple et rapide
  • Sensibilité modérée

Désavantages:

  • Besoin d'un spectrophotomètre capable de lire dans la région UV
  • Nécessité d'utiliser des cuvettes en quartz
  • Ne peut pas être utilisé avec des protéines qui ne contiennent pas de résidus aromatiques
  • La contamination par les acides nucléiques peut être un problème

Méthode Biuret

Le test du biuret est un test permettant de détecter la présence de liaisons peptidiques. Dans des conditions alcalines, Cu2+ forme un complexe de couleur violette. La concentration en protéines est directement proportionnelle à l'intensité de la couleur, absorbée à 540 nm.

Le réactif Biuret contient de l'hydroxyde de sodium, du sulfate de cuivre (II) hydraté et du tartrate de potassium et de sodium (pour stabiliser les complexes). La réduction du cuivre entraîne un changement de couleur, qui peut être lu à 550 nm. La plage linéaire est généralement de 0,5 à 20 mg de protéine.

  • Ne dépend pas de la composition en acides aminés de la protéine
  • Ne nécessite pas de spectrophotomètre capable de mesurer dans la région UV
  • Bon pour les échantillons de tissus entiers et d'autres sources de concentration élevée en protéines
  • Relativement peu de matériaux interfèrent avec le dosage

Désavantages:

  • Les tampons, tels que le Tris et l'ammoniac, peuvent interférer avec la réaction
  • Impossible de mesurer la concentration de protéines précipitées à l'aide de sulfate d'ammonium
  • Pas aussi sensible que d'autres méthodes - nécessite des quantités plus élevées de protéines
  • Besoin de mettre en place une courbe standard
  • La contamination par les acides nucléiques peut être un problème
  • Les protéines avec un pourcentage anormalement élevé ou faible d'acides aminés aromatiques donneront des lectures élevées ou faibles

La méthode Lowry

Le développement de la méthode Lowry (du nom d'Oliver Lowry) a introduit un test plus sensible pour déterminer la concentration en protéines. La méthode de Lowry est sensible, hautement reproductible, peu coûteuse et facile à réaliser.

Modification du test de Biuret, la méthode de Lowry repose sur la réaction du cuivre avec les protéines, mais l'échantillon est également incubé avec le réactif de Folin-Ciocalteu. La réduction du réactif de Folin-Ciocalteu dans des conditions alcalines donne une couleur bleue intense (bleu hétéropolymolybdène) qui absorbe à 750 nm. La méthode de Lowry est mieux utilisée avec des concentrations de protéines de 0,01 à 1,0 mg/mL.

  • Facile à utiliser
  • Hautement reproductible
  • Peu coûteux
  • Gamme linéaire sensible et large

Désavantages:

  • Besoin de faire une courbe standard pour chaque test
  • La synchronisation et le mélange des réactifs doivent être précis
  • La sensibilité dépend de la composition de la protéine car la réaction dépend en partie des acides aminés polaires
  • Interférence de certains tampons, en particulier les détergents
  • Mieux adapté pour déterminer la concentration d'échantillons de la même protéine plutôt que comme mesure absolue
  • Le dosage peut être long

Dosage de l'acide bicinchoninique (BCA)

Le BCA est similaire à Lowry, sauf que l'acide bicinchoninique (BCA) est utilisé à la place du réactif de Folin-Ciocalteu. Après réduction des ions Cu2+, deux molécules de BCA se chélatent avec chaque ion Cu+, ce qui entraîne la formation d'une couleur pourpre intense qui absorbe à 560 nm.

Le BCA est aussi sensible que la méthode de Lowry et fonctionne bien avec des concentrations de protéines de 0,5 g/mL à 1,5 mg/mL. Bien que les détergents n'interfèrent pas aussi fortement que dans la méthode Lowry, d'autres contaminants peuvent interférer avec la réaction. De plus, les acides aminés aromatiques peuvent influencer la réaction. Cependant, à des températures plus élevées (37-60°C), les liaisons peptidiques peuvent également contribuer à la formation du produit. Par conséquent, il est recommandé d'effectuer la réaction à des températures plus élevées pour augmenter la sensibilité et diminuer la variabilité due à la composition en acides aminés.

  • Facile à utiliser
  • Hautement reproductible
  • Peu coûteux
  • Gamme linéaire sensible et large

Désavantages:

  • Besoin de faire une courbe standard pour chaque test
  • Interférence des glucides, des catécholamines, du tryptophane, des lipides, du rouge de phénol, de la cystéine, de la tyrosine, du saccharose ou du glycérol impur, de l'acide urique, du fer et du peroxyde d'hydrogène
  • La couleur continue de se développer avec le temps, mais est stable pour la mesure après 30 minutes à 37°C

Dosages de liaison au colorant

Les tests de liaison de colorant reposent sur un changement d'absorbance qui se produit lorsqu'un colorant se lie aux protéines. Plusieurs colorants différents peuvent être utilisés : Coomassie Brillant Blue G-250, vert de bromocrésol, rouge de pyrogallol et éosine y. Le test de liaison de colorant le plus couramment utilisé est le test de Bradford.

Test de Bradford

Le test Bradford, nommé d'après son développement, Marion M. Bradford, est une méthode simple, sensible et précise pour la quantification des protéines. La liaison du Coomassie Brillant Blue G-250 aux protéines provoque un déplacement du colorant du rouge (465 nm) au bleu (595 nm) dans des conditions acides. Il est compatible avec les réactifs les plus courants, bien que les détergents puissent provoquer des interférences. Les protéines avec une concentration de 20 à 2000 g/mL peuvent être mesurées à l'aide du test de Bradford.


Bandes multiples dans les Western Blots – Causes et solutions

Le test Western blot fournit des informations précieuses sur une protéine, y compris l'abondance, la masse moléculaire apparente, les modifications post-traductionnelles et les variantes d'épissage. Cependant, l'analyse de la protéine peut être difficile si plusieurs bandes apparaissent sur le transfert. Lorsqu'il s'agit de bandes multiples sur des transferts Western, il est important de déterminer si elles sont dues à des artefacts techniques ou si elles représentent de véritables variantes de la protéine d'intérêt. Ce guide décrit diverses causes de bandes multiples dues à des artefacts techniques et comment déterminer si plusieurs bandes représentent de véritables variantes de la protéine d'intérêt.

Bandes multiples causées par des artefacts techniques

Des artefacts techniques peuvent provoquer l'apparition de bandes ayant des poids moléculaires supérieurs ou inférieurs à la protéine réelle. Les types de bandes observées peuvent aider à déterminer la cause de l'artefact.

Bandes de poids moléculaire inférieure et supérieure

Concentration d'anticorps primaire ou secondaire trop élevée

Si la concentration de l'anticorps primaire ou secondaire est trop élevée, l'anticorps peut se lier de manière non spécifique à des protéines autres que la protéine d'intérêt. Une liaison non spécifique peut se produire avec n'importe quelle protéine, ainsi des bandes de poids moléculaire supérieur et inférieur peuvent être observées.

Titrer l'anticorps

Pour déterminer si des concentrations élevées d'anticorps entraînent des bandes multiples, titrez les anticorps. Les deux anticorps peuvent être titrés simultanément à l'aide d'un dot blot à la manière d'un damier.

Pas de contrôle primaire d'anticorps

Pour déterminer rapidement si l'anticorps primaire est responsable de la production de plusieurs bandes sur le transfert, effectuez toute la procédure de transfert Western mais omettez l'anticorps primaire. Si plusieurs bandes sont encore observées, alors l'anticorps secondaire est responsable des artefacts.

Quantité excessive de lysat chargé sur le gel

Si trop de lysat est chargé sur un gel, les anticorps peuvent se lier de manière non spécifique aux protéines d'abondance excessive, ce qui entraîne des bandes multiples.

Diminuer la quantité de lysat utilisé

Pour déterminer la quantité appropriée de lysat à charger sur le gel, chargez des dilutions décroissantes de lysat sur le gel.

Augmenter les lavages

Si la protéine d'intérêt n'est pas très abondante, il peut être nécessaire de charger de grandes quantités de protéine pour détecter la protéine. Pour diminuer la liaison non spécifique aux protéines de plus grande abondance, augmentez le nombre et la durée des lavages.

L'anticorps est "sale"

Les sérums polyclonaux ou les anticorps non purifiés peuvent également contenir des anticorps moins abondants qui se lient à des protéines cellulaires communes abondantes.

Utiliser un anticorps purifié par affinité

Dans la mesure du possible, achetez des anticorps purifiés par affinité. En variante, les antisérums polyclonaux peuvent être purifiés par affinité en utilisant la protéine A, G ou L immobilisée pour purifier les molécules d'IgG ou l'antigène immobilisé peut être utilisé pour purifier les anticorps spécifiques de l'antigène. Des kits commerciaux sont disponibles pour la purification par affinité des anticorps.

Bandes de poids moléculaire inférieur

Dégradation de la protéine cible

De multiples bandes de poids moléculaire inférieur résultent généralement d'une mauvaise manipulation des lysats/échantillons avant l'analyse et peuvent indiquer une dégradation de l'échantillon.

Inhibiteurs de protéase

Pour diminuer la dégradation des protéines par les protéases cellulaires, incluez des inhibiteurs de protéase dans la solution de lyse utilisée pour la préparation des échantillons.

Conserver les échantillons au froid

Gardez les échantillons sur la glace pendant la préparation et pendant toutes les manipulations pour limiter l'activité de la protéase.

Limiter le gel/dégel

Aliquoter les échantillons dans plusieurs tubes et congeler/décongeler chaque tube seulement 1 à 2 fois pour limiter la dégradation induite par les changements de température.

Bandes de poids moléculaire supérieur

Les bandes de poids moléculaire plus élevé peuvent également être dues à des artefacts techniques.

La protéine cible peut former des multimères

Les multimères de protéines non résolus peuvent entraîner des bandes de poids moléculaire qui sont supérieures au poids moléculaire prédit de la protéine cible.

Faire bouillir dans le tampon SDS-PAGE pendant 10 minutes

Pour réduire complètement les protéines, faire bouillir l'échantillon dans du tampon SDS-PAGE contenant un agent dénaturant tel que le dithiothréitol ou le -mercaptoéthanol pendant 10 minutes au lieu des 5 minutes habituelles.

Comparez le gel réducteur au gel non réducteur

Pour déterminer si la protéine d'intérêt forme des multimères, préparez les échantillons dans des conditions réductrices et non réductrices avant de les charger sur le gel.

Déterminer si plusieurs bandes sont scientifiquement pertinentes

Plusieurs bandes qui sont scientifiquement pertinentes peuvent être observées lors de l'analyse Western blot. Des bandes de poids moléculaire plus élevé sont observées lorsque les protéines se lient à des modificateurs, tandis que des bandes de poids moléculaire plus faible sont observées lorsque les protéines sont épissées.

Déterminer si les bandes sont spécifiquement reconnues par l'anticorps

L'un des critères pour déterminer si plusieurs bandes sont dues à des artefacts techniques ou sont scientifiquement pertinentes, est de déterminer si les bandes sont spécifiquement reconnues par l'anticorps primaire. Ceci peut être réalisé en utilisant des échantillons témoins et/ou en inhibant spécifiquement l'interaction de l'anticorps avec la protéine.

Échantillons de contrôle

Incluez des contrôles sur le gel qui contiennent ou n'ont pas la protéine d'intérêt. Par exemple, incluez des lignées cellulaires identiques à tous égards, sauf dans l'expression de la protéine pour identifier les bandes qui apparaissent en raison d'interactions non spécifiques.

Peptides bloquants

Lorsqu'ils sont disponibles, des peptides bloquants (ceux qui correspondent à l'épitope reconnu par l'anticorps) peuvent être utilisés pour déterminer quelles bandes sont spécifiquement reconnues par l'anticorps. Pré-incuber l'anticorps primaire avec des concentrations croissantes de peptides bloquants avant l'incubation du transfert avec l'anticorps. Le peptide bloquant empêchera l'interaction de l'anticorps avec la protéine cible et la bande "disparaîtra" sur le transfert.

Bandes de poids moléculaire plus élevé

Des bandes de poids moléculaire plus élevé sont souvent observées lorsque la protéine cible est modifiée de manière post-traductionnelle. L'acétylation, la méthylation, la myristoylation, la phosphorylation, la glycosylation et l'ubiquitination sont toutes des modifications qui augmentent le poids moléculaire d'une protéine. Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour déterminer si une protéine est modifiée post-traductionnellement.

Logiciel d'analyse de protéines

Utilisez un logiciel d'analyse de protéines pour prédire les types de modifications qu'une protéine peut acquérir après la traduction. Utilisez le logiciel pour prédire le poids moléculaire de la protéine avec et sans modifications.

Anticorps spécifiques pour modification

Des anticorps primaires disponibles dans le commerce sont disponibles qui reconnaissent des modifications post-traductionnelles spécifiques (par exemple, des anticorps spécifiques de la phosphorylation de la tyrosine). Ces anticorps peuvent être utilisés pour confirmer des modifications post-traductionnelles. Pour utiliser ces anticorps, immunoprécipiter la protéine d'intérêt en utilisant l'anticorps primaire spécifique de la protéine. Exécutez la fraction immunoprécipitée sur un gel, puis effectuez un Western blot en utilisant l'anticorps primaire spécifique de la modification.

Traitements chimiques pour supprimer les modifications

Les protéines et les extraits de protéines peuvent être traités avec des produits chimiques qui supprimeront les modifications (par exemple, la PNGase F est utilisée pour supprimer les glycosylations). L'élimination complète de toutes les modifications devrait se traduire par une seule bande du poids moléculaire prédit dans l'analyse par transfert Western. Lors du traitement avec des produits chimiques pour éliminer les modificateurs, il est important d'inclure également des échantillons non traités sur le même gel pour observer les changements dans le motif de bandes.

Bandes de poids moléculaire inférieur

Des bandes de poids moléculaire inférieur peuvent être observées si des formes supplémentaires de la protéine d'intérêt sont générées par un épissage alternatif ou un clivage de la protéine post-traductionnelle. Des logiciels d'analyse d'ARN et de protéines peuvent être utilisés pour prédire ces événements, mais ces modifications devront être déterminées empiriquement pour chaque protéine.

Variantes d'épissure

L'épissage alternatif d'un ARNm peut générer plusieurs produits protéiques. Si l'épitope que l'anticorps reconnaît est partagé entre les protéines, alors plusieurs bandes seront observées.

La protéine est clivée

Des bandes de poids moléculaire inférieur peuvent être observées si la protéine est clivée après la traduction. Les anticorps polyclonaux peuvent reconnaître plusieurs bandes de poids moléculaire inférieur en raison de leur capacité à reconnaître plusieurs épitopes. Les anticorps monoclonaux ne reconnaîtront qu'une seule bande du ou des produits de clivage.


Capture de données

Le signal de western blot chimiluminescent peut être capturé avec un film à rayons X, des instruments d'imagerie numérique à base de caméra à couplage de charge (CCD) et des phosphorimagers qui détectent la chimiluminescence. Bien que le film radiographique fournisse des données qualitatives et semi-quantitatives et soit utile pour confirmer la présence de protéines cibles, les instruments d'imagerie basés sur des caméras CCD offrent les avantages d'une analyse qualitative, d'une capture et d'une analyse d'images instantanées, d'une sensibilité plus élevée, d'une plus grande résolution et d'une plus grande plage dynamique que le film. De plus, il n'est pas nécessaire d'avoir un espace de chambre noire et un équipement de développement dédiés. Les instruments d'imagerie peuvent être placés directement sur une paillasse à côté d'autres équipements de laboratoire.

Caméras CCD pour la capture d'images chimiluminescentes

AvantagesLimites
Plage dynamique avec >4 ordres de grandeurDes expositions prolongées (> 60 minutes) peuvent entraîner une augmentation du bruit de fond de l'appareil photo
Des algorithmes intelligents aident à déterminer le temps d'exposition optimal
Analyse et stockage d'images rationalisés
Visualisation instantanée des résultats
Quantitatif
Les systèmes d'imagerie iBright disposent d'une caméra CCD refroidie de 9,1 MP qui offre une sensibilité élevée et une plage dynamique pour aider à permettre la détection de différences subtiles dans les échantillons.

Souvent, il est nécessaire d'exposer plusieurs films pendant différentes périodes de temps pour obtenir le bon équilibre entre le signal et l'arrière-plan. L'objectif est de chronométrer l'exposition des membranes au film de manière à ce que le signal souhaité soit clairement visible tandis que le bruit de fond reste faible. Ceci est difficile à réaliser car le processus ne peut pas être observé et arrêté lorsque le point final souhaité est atteint. Si le film n'est pas exposé assez longtemps (sous-exposé), le signal ne sera pas visible. Si le film est exposé trop longtemps (surexposé), le signal peut être perdu en arrière-plan ou des bandes distinctes peuvent devenir floues ensemble. De plus, juger du temps d'exposition optimal est hautement subjectif, car il est difficile de déterminer visuellement le point précis auquel le meilleur équilibre signal/bruit est obtenu. Des épisodes répétés d'exposition et de développement du film sont souvent effectués, ce qui peut représenter un investissement de temps considérable. Une fois les données capturées sur film, le film est souvent numérisé pour en faire une copie numérique, qui est ensuite exportée vers un logiciel d'analyse pour faciliter une analyse plus approfondie, telle que la densitométrie et l'estimation du poids moléculaire.

L'un des plus grands avantages des systèmes d'imagerie numérique est la possibilité d'affiner le temps d'exposition (certains systèmes offrent la possibilité d'ajuster le temps d'exposition au millième de seconde). En outre, de nombreux systèmes offrent un réglage d'exposition automatique spécifique qui utilise des algorithmes qui déterminent automatiquement le temps d'exposition optimal, qui non seulement capture une image avec un rapport signal/bruit optimal, mais permet également de gagner un temps considérable par rapport aux expositions multiples souvent requises. avec le cinéma. Étant donné que les données sont capturées numériquement, elles peuvent être facilement exportées vers un logiciel d'analyse (éliminant l'étape de numérisation avec un film). Certains des systèmes les plus modernes offrent la possibilité d'effectuer des analyses directement sur l'instrument. Ces commodités font de l'imagerie numérique un remplacement populaire pour la capture de données sur film.


Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)

Après ces étapes de préparation des échantillons, la PAGE est effectuée pour séparer les protéines dénaturées et chargées négativement en fonction de leur poids moléculaire. La séparation des échantillons de protéines dans les gels de polyacrylamide se produit en raison de la résistance à la friction d'une protéine lorsqu'elle migre à travers les pores formés entre les chaînes polymères à l'intérieur du gel (Ornstein, 1964). Les gels de polyacrylamide comprennent des monomères d'acrylamide polymérisés ainsi que des monomères de réticulation N,N′-méthylènebisacrylamide (Raymond & Weintraub, 1959), créant des pores de taille uniforme, dépendant à la fois de la concentration en monomère et du rapport de réticulation. As an electrical current is passed, proteins move through pores within the gel structure as such, altering the bis-acrylamide concentration regulates pore size and consequently the ability of larger proteins to migrate. Gels with a higher acrylamide concentration (e.g., 20%) impede the movement of larger proteins to a greater degree than those of a smaller molecular weight but better resolve those of lower molecular weights (e.g., 4EBP1

20 kDa) (Chrambach & Rodbard, 1971 ). Similarly, if the desired target is a large protein (e.g., mTOR

289 kDa), a lower concentration gel (e.g., 7.5%) may be required for optimal resolution. Alternatively gradient gels (e.g., 4–12%) provide uniform resolution across the molecular-weight spectrum (Rath et al., 2013 ). Other gel types such as agarose may be used, but are less common as they are predominantly used for very large molecular-weight proteins (e.g., titin isoforms 700–4200 kDa) giving superior separation when compared to polyacrylamide gels (Warren et al., 2003 ). Agarose gels may be hand-cast but require storage at 4°C to prevent drying out. Other hand-cast gels may also require use soon after casting and may vary between runs due to the short shelf life of some chemicals. The choice between commercial and hand-cast gels is generally the preference of the user, but commercial gels are generally more consistent. Ultimately, the concentration of the cross-linking molecules and the molecular weight of the protein(s) of interest are the determining factors for gel choice as taken together these will allow for efficient migration and optimal band resolution. The choice of gel concentration and composition is mainly determined by the molecular weight of the protein(s) of interest, as it will allow efficient migration and optimal band resolution.

Whereas electrophoresis of nucleic acids utilizes a constant pH within the buffer and gel to achieve discernable separation (Westermeier, 2005 ), protein samples require a discontinuous buffer system (Ornstein, 1964 ). Discontinuous systems utilize gels separated into two regions, comprising a “stacking gel” above a “resolving or separating gel” with larger and smaller pores, respectively. Discontinuous systems are designed to focus protein samples and allow clear resolution of proteins. Initially, proteins migrate quickly through the large pore stacking gel until they reach the resolving gel, whereupon the smaller pore size slows migration, causing the proteins to stack together into compact bands (Ornstein, 1964 ). The second principle utilizes the electrophoretic migration of both ions and proteins through a pH-buffered solution. Chloride ions present within the gel have a higher mobility and therefore migrate faster than denatured proteins, establishing a leading ion boundary (Ornstein, 1964 ). Within traditional Tris-HCl stacking gels (pH 6.8), a trailing boundary of glycinate ions form behind migrating proteins due to reduced mobility at a low pH (Walker, 1994 ). Ultimately, migrating proteins are sandwiched between the two ion boundaries, stacking the sample into tightly focused bands, whereupon they migrate into the resolving gel containing smaller pores, slowing the progression of proteins dependent on their size as previously mentioned. Tris-HCl resolving gels are typically formed at pH 8.8 this higher pH allows the ionization of the trailing glycinate, increasing its mobility (Ornstein, 1964 ). Consequently, both chloride and glycinate boundaries will migrate past the protein samples, no longer constricting them into focused bands, allowing the unimpeded separation of proteins. Alternative gels and discontinuous buffer systems are available that may be better suited to the resolution of either larger or smaller molecular-weight proteins depending on sample composition. For example, Bis-Tris systems utilize different buffers containing either 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) or 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), which function as trailing boundary ions instead of glycinate (Hachmann & Amshey, 2005 ). These allow greater resolution of mid-sized (

75 kDa) or smaller (<36 kDa) proteins with MOPS or MES, respectively. Bis-Tris gels are cast at pH 6.8, offering significantly longer shelf life compared with Tris-HCl gels as they do not undergo acrylamide hydrolysis due to their acidic nature. Generally, electrophoresis is undertaken using a constant voltage, rather than a constant current, due to the linear relation of protein migration and voltage. As current is dependent on the voltage and resistance, a constant current will not control protein migration as changes in resistance (i.e., warming of the buffer) will cause the voltage to fluctuate. Depending on the apparatus, electrophoresis is typically performed for 60 min with a constant voltage of 200 V to give a suitable separation of protein lysates however, less time may be required for smaller molecular-weight proteins.


Contenu

The western blot is extensively used in biochemistry for the qualitative detection of single proteins and protein-modifications (such as post-translational modifications). At least 8-9% of all protein-related publications are estimated to apply western blots. [5] It is used as a general method to identify the presence of a specific single protein within a complex mixture of proteins. A semi-quantitative estimation of a protein can be derived from the size and color intensity of a protein band on the blot membrane. In addition, applying a dilution series of a purified protein of known concentrations can be used to allow a more precise estimate of protein concentration. The western blot is routinely used for verification of protein production after cloning. It is also used in medical diagnostics, e.g., in the HIV test or BSE-Test.

The confirmatory HIV test employs a western blot to detect anti-HIV antibody in a human serum sample. Proteins from known HIV-infected cells are separated and blotted on a membrane as above. Then, the serum to be tested is applied in the primary antibody incubation step free antibody is washed away, and a secondary anti-human antibody linked to an enzyme signal is added. The stained bands then indicate the proteins to which the patient's serum contains antibody. [6] A western blot is also used as the definitive test for variant Creutzfeldt-Jakob Disease, a type of prion disease linked to the consumption of contaminated beef from cattle with Bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease'). [7]

Another application is in the diagnosis of tularemia. An evaluation of the western blot's ability to detect antibodies against F. tularensis revealed that its sensitivity is almost 100% and the specificity is 99.6%. [8]

Some forms of Lyme disease testing employ western blotting. [9] A western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection and HSV-2 (Herpes Type 2) infection. [10] [11] In veterinary medicine, a western blot is sometimes used to confirm FIV+ status in cats. [12]

Further applications of the western blot technique include its use by the World Anti-Doping Agency (WADA). Blood doping is the misuse of certain techniques and/or substances to increase one's red blood cell mass, which allows the body to transport more oxygen to muscles and therefore increase stamina and performance. There are three widely known substances or methods used for blood doping, namely, erythropoietin (EPO), synthetic oxygen carriers and blood transfusions. Each is prohibited under WADA's List of Prohibited Substances and Methods. The western blot technique was used during the 2014 FIFA World Cup in the anti-doping campaign for that event. [13] In total, over 1000 samples were collected and analyzed by Reichel, et al. [14] in the WADA accredited Laboratory of Lausanne, Switzerland. Recent research utilizing the western blot technique showed an improved detection of EPO in blood and urine based on novel Velum SAR precast horizontal gels optimized for routine analysis. [15] With the adoption of the horizontal SAR-PAGE in combination with the precast film-supported Velum SAR gels the discriminatory capacity of micro-dose application of rEPO was significantly enhanced.

The western blot method is composed of a gel electrophoresis to separate native proteins by 3-D structure or denatured proteins by the length of the polypeptide, followed by an electrophoretic transfer onto a membrane (mostly PVDF or Nitrocellulose) and an immunostaining procedure to visualize a certain protein on the blot membrane. SDS-PAGE is generally used for the denaturing electrophoretic separation of proteins. SDS is generally used as a buffer (as well as in the gel) in order to give all proteins present a uniform negative charge, since proteins can be positively, negatively, or neutrally charged. This type of electrophoresis is known as SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). Prior to electrophoresis, protein samples are often boiled to denature the proteins present. This ensures that proteins are separated based on size and prevents proteases (enzymes that break down proteins) from degrading samples. Following electrophoretic separation, the proteins are transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF). The membrane is often then stained with Ponceau S in order to visualize the proteins on the blot and ensure a proper transfer occurred. Next the proteins are blocked with milk (or other blocking agents) to prevent non-specific antibody binding, and then stained with antibodies specific to the target protein. [4] [16] Lastly, the membrane will be stained with a secondary antibody that recognizes the first antibody staining, which can then be used for detection by a variety of methods. The gel electrophoresis step is included in western blot analysis to resolve the issue of the cross-reactivity of antibodies.

Gel electrophoresis Edit

The proteins of the sample are separated using gel electrophoresis. Separation of proteins may be by isoelectric point (pI), molecular weight, electric charge, or a combination of these factors. The nature of the separation depends on the treatment of the sample and the nature of the gel.

By far the most common type of gel electrophoresis employs polyacrylamide gels and buffers loaded with sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) maintains polypeptides in a denatured state once they have been treated with strong reducing agents to remove secondary and tertiary structure (e.g. disulfide bonds [S-S] to sulfhydryl groups [SH and SH]) and thus allows separation of proteins by their molecular mass. Sampled proteins become covered in the negatively charged SDS, effectively becoming anionic, and migrate towards the positively charged (higher voltage) anode (usually having a red wire) through the acrylamide mesh of the gel. Smaller proteins migrate faster through this mesh, and the proteins are thus separated according to size (usually measured in kilodaltons, kDa). The concentration of acrylamide determines the resolution of the gel – the greater the acrylamide concentration, the better the resolution of lower molecular weight proteins. The lower the acrylamide concentration, the better the resolution of higher molecular weight proteins. Proteins travel only in one dimension along the gel for most blots.

Samples are loaded into puits in the gel. One lane is usually reserved for a marqueur ou échelle, which is a commercially available mixture of proteins of known molecular weights, typically stained so as to form visible, coloured bands. When voltage is applied along the gel, proteins migrate through it at different speeds dependent on their size. These different rates of advancement (different electrophoretic mobilities) separate into bands au sein de chaque voie. Protein bands can then be compared to the ladder bands, allowing estimation of the protein's molecular weight.

It is also possible to use a two-dimensional gel which spreads the proteins from a single sample out in two dimensions. Proteins are separated according to isoelectric point (pH at which they have a neutral net charge) in the first dimension, and according to their molecular weight in the second dimension.

Transfer Edit

To make the proteins accessible to antibody detection, they are moved from within the gel onto a membrane, a solid support, it’s an essential part of the process. There are two types of membrane: nitrocellulose (NC) or polyvinylidene difluoride (PVDF). NC membrane has high affinity for protein and its retention abilities. however, NC is brittle, and does not allow the blot to be used for re-probing. whereas, PVDF membrane allows the blot to be re-probed. [17] The most commonly used method for transferring the proteins is called electroblotting. Electroblotting uses an electric current to pull the negatively charged proteins from the gel towards the positively charged anode, and into the PVDF or NC membrane. The proteins move from within the gel onto the membrane while maintaining the organization they had within the gel. An older method of transfer involves placing a membrane on top of the gel, and a stack of filter papers on top of that. The entire stack is placed in a buffer solution which moves up the paper by capillary action, bringing the proteins with it. In practice this method is not commonly used due to the lengthy procedure time.

As a result of either transfer process, the proteins are exposed on a thin membrane layer for detection. Both varieties of membrane are chosen for their non-specific protein binding properties (i.e. binds all proteins equally well). Protein binding is based upon hydrophobic interactions, as well as charged interactions between the membrane and protein. Nitrocellulose membranes are cheaper than PVDF, but are far more fragile and cannot withstand repeated probings.

Total protein staining Edit

Total protein staining allows the total protein that has been successfully transferred to the membrane to be visualised, allowing the user to check the uniformity of protein transfer and to perform subsequent normalization of the target protein with the actual protein amount per lane. Normalization with the so-called "loading control" was based on immunostaining of housekeeping proteins in the classical procedure, but is heading toward total protein staining recently, due to multiple benefits. [18] At least seven different approaches for total protein staining have been described for western blot normalization: Ponceau S, stain-free techniques, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Amido Black, and Cy5. [18] In order to avoid noise of signal, total protein staining should be performed before blocking of the membrane. Nevertheless, post-antibody stainings have been described as well. [19]

Blocking Edit

Since the membrane has been chosen for its ability to bind protein and as both antibodies and the target are proteins, steps must be taken to prevent the interactions between the membrane and the antibody used for detection of the target protein. Blocking of non-specific binding is achieved by placing the membrane in a dilute solution of protein – typically 3–5% bovine serum albumin (BSA) or non-fat dry milk (both are inexpensive) in tris-buffered saline (TBS) or I-Block, with a minute percentage (0.1%) of detergent such as Tween 20 or Triton X-100. Although non-fat dry milk is preferred due to its availability, an appropriate blocking solution is needed as not all proteins in milk are compatible with all the detection bands. [20] The protein in the dilute solution attaches to the membrane in all places where the target proteins have not attached. Thus, when the antibody is added, it cannot bind to the membrane, and therefore the only available binding site is the specific target protein. This reduces background in the final product of the western blot, leading to clearer results, and eliminates false positives.

Incubation Edit

During the detection process the membrane is "probed" for the protein of interest with a modified antibody which is linked to a reporter enzyme when exposed to an appropriate substrate, this enzyme drives a colorimetric reaction and produces a color. For a variety of reasons, this traditionally takes place in a two-step process, although there are now one-step detection methods available for certain applications.

Primary antibody Edit

The primary antibodies are generated when a host species or immune cell culture is exposed to the protein of interest (or a part thereof). Normally, this is part of the immune response, whereas here they are harvested and used as sensitive and specific detection tools that bind the protein directly.

After blocking, a solution of primary antibody (generally between 0.5 and 5 micrograms/mL) diluted in either PBS or TBST wash buffer is incubated with the membrane under gentle agitation for typically an hour at room temperature, or overnight at 4°C. The antibody solution is incubated with the membrane for anywhere from 30 minutes to overnight. It can also be incubated at different temperatures, with lesser temperatures being associated with more binding, both specific (to the target protein, the "signal") and non-specific ("noise"). Following incubation, the membrane is washed several times in wash buffer to remove unbound primary antibody, and thereby minimize background. [20] Typically, the wash buffer solution is composed of buffered saline solution with a small percentage of detergent, and sometimes with powdered milk or BSA.

Secondary antibody Edit

After rinsing the membrane to remove unbound primary antibody, the membrane is exposed to another antibody known as the secondary antibody. Antibodies come from animal sources (or animal sourced hybridoma cultures). The secondary antibody recognises and binds to the species-specific portion of the primary antibody. Therefore, an anti-mouse secondary antibody will bind to almost any mouse-sourced primary antibody, and can be referred to as an 'anti-species' antibody (e.g. anti-mouse, anti-goat etc.). To allow detection of the target protein, the secondary antibody is commonly linked to biotin or a reporter enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. This means that several secondary antibodies will bind to one primary antibody and enhance the signal, allowing the detection of proteins of a much lower concentration than would be visible by SDS-PAGE alone.

Horseradish peroxidase (HRP) is commonly linked to secondary antibodies to allow the detection of the target protein by chemiluminescence. The chemiluminscent substrate is cleaved by HRP, resulting in the production of luminescence. Therefore, the production of luminescence is proportional to the amount of HRP-conjugated secondary antibody, and therefore, indirectly measures the presence of the target protein. A sensitive sheet of photographic film is placed against the membrane, and exposure to the light from the reaction creates an image of the antibodies bound to the blot. A cheaper but less sensitive approach utilizes a 4-chloronaphthol stain with 1% hydrogen peroxide the reaction of peroxide radicals with 4-chloronaphthol produces a dark purple stain that can be photographed without using specialized photographic film.

As with the ELISPOT and ELISA procedures, the enzyme can be provided with a substrate molecule that will be converted by the enzyme to a colored reaction product that will be visible on the membrane (see the figure below with blue bands).

Another method of secondary antibody detection utilizes a near-infrared (NIR) fluorophore-linked antibody. The light produced from the excitation of a fluorescent dye is static, making fluorescent detection a more precise and accurate measure of the difference in the signal produced by labeled antibodies bound to proteins on a western blot. Proteins can be accurately quantified because the signal generated by the different amounts of proteins on the membranes is measured in a static state, as compared to chemiluminescence, in which light is measured in a dynamic state. [21]

A third alternative is to use a radioactive label rather than an enzyme coupled to the secondary antibody, such as labeling an antibody-binding protein like Staphylocoque Protein A or Streptavidin with a radioactive isotope of iodine. Since other methods are safer, quicker, and cheaper, this method is now rarely used however, an advantage of this approach is the sensitivity of auto-radiography-based imaging, which enables highly accurate protein quantification when combined with optical software (e.g. Optiquant).

One step Edit

Historically, the probing process was performed in two steps because of the relative ease of producing primary and secondary antibodies in separate processes. This gives researchers and corporations huge advantages in terms of flexibility, reduction of cost, and adds an amplification step to the detection process. Given the advent of high-throughput protein analysis and lower limits of detection, however, there has been interest in developing one-step probing systems that would allow the process to occur faster and with fewer consumables. This requires a probe antibody which both recognizes the protein of interest and contains a detectable label, probes which are often available for known protein tags. The primary probe is incubated with the membrane in a manner similar to that for the primary antibody in a two-step process, and then is ready for direct detection after a series of wash steps.

Detection and visualization Edit

After the unbound probes are washed away, the western blot is ready for detection of the probes that are labeled and bound to the protein of interest. In practical terms, not all westerns reveal protein only at one band in a membrane. Size approximations are taken by comparing the stained bands to that of the marker or ladder loaded during electrophoresis. The process is commonly repeated for a structural protein, such as actin or tubulin, that should not change between samples. The amount of target protein is normalized to the structural protein to control between groups. A superior strategy is the normalization to the total protein visualized with trichloroethanol [22] [23] or epicocconone. [24] This practice ensures correction for the amount of total protein on the membrane in case of errors or incomplete transfers. (see western blot normalization)

Colorimetric detection Edit

The colorimetric detection method depends on incubation of the western blot with a substrate that reacts with the reporter enzyme (such as peroxidase) that is bound to the secondary antibody. This converts the soluble dye into an insoluble form of a different color that precipitates next to the enzyme and thereby stains the membrane. Development of the blot is then stopped by washing away the soluble dye. Protein levels are evaluated through densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.

Chemiluminescent detection Edit

Chemiluminescent detection methods depend on incubation of the western blot with a substrate that will luminesce when exposed to the reporter on the secondary antibody. The light is then detected by CCD cameras which capture a digital image of the western blot or photographic film. The use of film for western blot detection is slowly disappearing because of non linearity of the image (non accurate quantification). The image is analysed by densitometry, which evaluates the relative amount of protein staining and quantifies the results in terms of optical density. Newer software allows further data analysis such as molecular weight analysis if appropriate standards are used.

Radioactive detection Edit

Radioactive labels do not require enzyme substrates, but rather, allow the placement of medical X-ray film directly against the western blot, which develops as it is exposed to the label and creates dark regions which correspond to the protein bands of interest (see image above). The importance of radioactive detections methods is declining due to its hazardous radiation [ citation requise ] , because it is very expensive, health and safety risks are high, and ECL (enhanced chemiluminescence) provides a useful alternative.

Fluorescent detection Edit

The fluorescently labeled probe is excited by light and the emission of the excitation is then detected by a photosensor such as a CCD camera equipped with appropriate emission filters which captures a digital image of the western blot and allows further data analysis such as molecular weight analysis and a quantitative western blot analysis. Fluorescence is considered to be one of the best methods for quantification but is less sensitive than chemiluminescence. [25]

Secondary probing Edit

One major difference between nitrocellulose and PVDF membranes relates to the ability of each to support "stripping" antibodies off and reusing the membrane for subsequent antibody probes. While there are well-established protocols available for stripping nitrocellulose membranes, the sturdier PVDF allows for easier stripping, and for more reuse before background noise limits experiments. Another difference is that, unlike nitrocellulose, PVDF must be soaked in 95% ethanol, isopropanol or methanol before use. PVDF membranes also tend to be thicker and more resistant to damage during use.


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Information additionnelle

Intérêts concurrents

The authors have no competing interests to declare.

Contributions des auteurs

EZ performed the proteomic analysis and contributed to its design, the 2-DE and gel image analysis, and the statistical analysis on the proteomic data, and drafted the manuscript. AM contributed to the overall experimental design of the proteomic analysis and to the preparation of the manuscript. ST and MP performed the LC-MS/MS analyses and identified the relevant spots MP and ART ran the Western blot analyses. SY and CG conceived the overall experimental design, and managed the chicken growth and sampling phases. MC generally coordinated the study, contributed to the proteomic experiment design, and was involved in fund raising and manuscript preparation. All authors have read and approved the final manuscript.


Voir la vidéo: Western Blot WB Visual Protocol (Février 2023).