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Pourquoi digérer les protéines en peptides pour la chromatographie liquide - spectrométrie de masse ?


La digestion (trypsine ou toute autre enzyme protéolytique) des protéines génère de multiples peptides, de sorte que le degré de complexité de l'échantillon, au niveau des peptides, augmente considérablement. De plus, il y a le problème d'inférer la protéine d'origine à partir de ses peptides constitutifs. Pourquoi cette étape de digestion est-elle nécessaire alors qu'il faut revenir au niveau des protéines ? Est-ce juste une limitation technologique ?


Cela va être une réponse très longue mais pour donner une réponse courte.

Vous devez considérer que MS pour la détection de peptides fonctionne sur les bases/principe de masse à charger (m/z) pour détecter une molécule AA, qui est ensuite normalisée et analysée etc etc (http://en.wikipedia.org/wiki /Spectrométrie de masse). Une fois que vous avez les acides aminés, vous regardez simplement l'ordre dans lequel ils passent et vous avez votre séquence peptidique. Veuillez lire sur les ions de type B, A et Y bien que cette page soit légèrement technique (http://www.matrixscience.com/help/fragmentation_help.html). Si les protéines n'étaient pas digérées, elles seraient beaucoup trop grosses pour être analysées car elles seraient lues comme une énorme goutte de m/z, ce qui pourrait être n'importe quoi ! Donc, une fois que vous avez votre spectre d'un peptide, vous devez le comparer à un spectre modèle, et sur cette base, vous prédisez quelle est la séquence car les pics de fragmentation peuvent être n'importe quoi. Regardez SEQUEST (http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_mass_spectrometry_software). Maintenant, il y a des tonnes d'algorithmes de correction qui sont appliqués, que vous pouvez rechercher.

Maintenant, la RP-LC est effectuée avant MS pour éviter que tout l'échantillon ne se précipite dans la machine MS en même temps, car la machine ne peut pas faire face si trop d'échantillon est inséré, donc le débit est contrôlé. Ce que je pense que vous pensez en termes de limite de machine définie, c'est le fragment peptidique (digéré) qui entre dans la machine, avant de subir une électropulvérisation. Maintenant, les experts qui utilisent les machines MS définissent une limite supérieure et inférieure de masse de peptide, pour quelle taille/masse de fragment accepter et quelle taille/masse ignorer. Regardez cet exemple de résumé théorique (http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest). Cela se produit fréquemment avec la digestion à la trypsine car elle reconnaît l'AA spécifique avant le clivage (http://en.wikipedia.org/wiki/Trypsin). De nos jours, la SEP a tellement progressé que nous avons des machines telles que Orbitrap (http://en.wikipedia.org/wiki/Orbitrap), qui peuvent gérer des peptides, digérés avec de l'élastase, qui se clive de manière non spécifique, ce qui signifie que vous sont moins susceptibles d'obtenir des peptides beaucoup trop gros pour l'analyse, augmentant ainsi la couverture protéique.

J'espère que cela t'aides!


J'ai trouvé la réponse à ma propre question. Elle a été formulée dans une publication de Nature par Mathias Mann, un pape en protéomique :

Pourquoi les peptides, et non les protéines, sont-ils séquencés ?

Après la purification des protéines, la première étape consiste à convertir les protéines en un ensemble de peptides à l'aide d'une protéase spécifique à la séquence. Même si les spectromètres de masse peuvent mesurer la masse de protéines intactes, il existe un certain nombre de raisons pour lesquelles les peptides, et non les protéines, sont analysés en protéomique. Les protéines peuvent être difficiles à manipuler et peuvent ne pas être toutes solubles dans les mêmes conditions (il convient de noter ici que de nombreux détergents interfèrent avec la SEP, car ils s'ionisent bien et sont en énorme excès par rapport aux protéines). De plus, la sensibilité du spectromètre de masse pour les protéines est beaucoup plus faible que pour les peptides, et la protéine pourrait être traitée et modifiée de telle sorte que l'effet combinatoire rend impossible la détermination des masses des nombreuses isoformes résultantes. De plus, il n'est pas facile de prédire à partir de la séquence quelle sera la masse d'une protéine mature et correctement modifiée ou, au contraire, quelle protéine aurait pu donner lieu à une masse protéique mesurée. Plus important encore, si le but est d'identifier la protéine, des informations de séquence sont nécessaires et le spectromètre de masse est le plus efficace pour obtenir des informations de séquence à partir de peptides d'une longueur maximale d'environ 20 résidus, plutôt que de protéines entières. Néanmoins, avec un équipement très spécialisé, il devient possible de dériver des informations de séquence partielle à partir de protéines intactes, qui peuvent ensuite être utilisées à des fins d'identification ou d'analyse de modifications de protéines dans une approche appelée séquençage 'top-down' des protéines.


Préparation de protéines et de peptides pour l'analyse par spectrométrie de masse dans un flux de travail protéomique ascendant

Cette unité décrit les étapes nécessaires pour préparer un échantillon pour l'analyse MS après séparation ou enrichissement des protéines par électrophorèse sur gel, chromatographie liquide et capture par affinité dans le contexte d'un flux de travail protéomique ascendant dans lequel la protéine est d'abord décomposée en peptides, soit par digestion chimique ou enzymatique, avant analyse MS. Sont également inclus des protocoles d'enrichissement au niveau des peptides, y compris l'enrichissement en phosphopeptides et la chromatographie en phase inversée pour la purification des échantillons immédiatement avant l'analyse MS. Enfin, il y a une discussion concernant les types de technologies MS couramment utilisées pour analyser les échantillons protéomiques, ainsi que les paramètres importants qui doivent être pris en compte lors de l'analyse des données MS pour assurer des identifications et une caractérisation rigoureuses et robustes des protéines. Cour. Protoc. Mol. Biol. 88:10.25.1-10.25.23. © 2009 par John Wiley & Sons, Inc.


Workflows de protéomique populaires

Protéomique ascendante

Un flux de travail protéomique qualitatif ou ascendant est conçu pour identifier autant de composants protéiques dans un échantillon biologique que possible grâce à une série de méthodes et de protocoles qui incluent la digestion des protéines, la séparation LC, la spectrométrie de masse et l'interprétation des données.

Phosphoprotéomique

L'une des modifications post-traductionnelles les plus étudiées et les plus importantes des protéines, la phosphorylation, communément appelée phosphoprotéomique, joue un rôle central dans la régulation de nombreux processus cellulaires et flux de travail impliquant l'enrichissement, la séparation, la spectrométrie de masse, l'exploration de données et la mesure des données phosphopeptides.

Glycosylation des protéines

La glycosylation joue un rôle vital dans une variété de processus biochimiques, car de nombreux glycanes subissent des changements de niveau d'expression liés à la maladie, et la détection et la quantification des changements offrent des informations diagnostiques essentielles. Les flux de travail standard impliquent l'enrichissement des échantillons, l'analyse par spectrométrie de masse avec plusieurs méthodes de fragmentation pour déterminer la composition en glycanes.

Protéomique translationnelle

Nos flux de travail de protéomique translationnelle offrent la standardisation et la reproductibilité nécessaires pour les études à grande échelle tout en aidant à ouvrir la voie et à accélérer le passage de la découverte aux applications cliniques, y compris la découverte de biomarqueurs protéiques qui peuvent conduire à des tests, des traitements et des pratiques pour améliorer la santé humaine .


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Couverture et sensibilité accrues du protéome

L'interface Thermo Scientific FAIMS Pro Duo améliore la sélectivité des précurseurs, améliorant les résultats qualitatifs et quantitatifs pour la plupart des applications de peptides et de protéines tout en réduisant les étapes de préparation des échantillons qui prennent du temps. L'interface FAIMS Pro Duo augmente les performances analytiques grâce au fractionnement en phase gazeuse et à l'amélioration sélective des composés peptidiques, réduisant la complexité des spectres MS et améliorant le rapport signal/bruit de l'analyte. Le résultat final est une plus grande couverture du protéome, une sensibilité améliorée et une quantification plus précise.


2 MATÉRIEL ET MÉTHODES

2.1 Culture cellulaire et purification d'anticorps

Les anticorps au format IgGsc ont été clonés comme décrit précédemment et ont été produits dans des cellules ExpiCHO-S™ ou FreeStyle™ CHO-S selon le protocole du fabricant (Thermo Fisher Scientific) (Zekri et al., 2020). Les anticorps ont ensuite été purifiés à partir du surnageant de culture cellulaire par des colonnes d'affinité HiTrap® MabSelect™ SuRe® et ensuite soumis à une chromatographie d'exclusion stérique (SEC) analytique et préparative à l'aide d'un Superdex 200 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) et d'un HiLoad® 16/ Colonne 600 Superdex® 200 pg (GE Healthcare), respectivement.

La cytométrie en flux a été utilisée pour analyser la liaison de bsAb aux cellules PSMA + LNCaP et aux splénocytes de souris C57BL/6. Pour l'identification des lymphocytes T CD4, le CD4-APC (clone GK1.5, 1:100, BioLegend) a été utilisé. F(ab) anti-humain de chèvre conjugué PE2 fragments (1:200, Jackson ImmunoResearch) ont été utilisés pour la détection d'anticorps non conjugués.

2.2 Électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide

Pour l'analyse SDS-PAGE, 3 à 10 µg de protéine ont été mélangés avec 2 x Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad Laboratories) et du β-mercaptoéthanol a été ajouté selon le protocole du fabricant pour la génération d'échantillons réduits. Avant le chargement, les échantillons ont été chauffés pendant 5 min à 95°C avant que les protéines ne soient séparées à l'aide d'une cellule d'électrophorèse verticale Mini-PROTEAN® Tetra à une tension constante de 100 V pendant 80 min. Un tampon Tris/glycine/SDS (Bio-Rad Laboratories) a été utilisé comme tampon de migration. Enfin, les bandes de protéines ont été colorées avec une solution de coloration au bleu brillant (50% H2O, 40 % de méthanol, 10 % d'acide acétique et 0,1 % de bleu brillant R 250) pendant 1 h, puis décoloré 2 × avec une solution de décoloration de Coomassie (50 % de H2O, 40 % de méthanol et 10 % d'acide acétique) pendant 1 h et pendant une nuit, respectivement.

2.3 Digestion en gel SDS-PAGE et extraction peptidique

Pour l'identification des protéines par MS, des régions de gel contenant des protéines ont été excisées avec un scalpel et soumises à une digestion en gel avec de la trypsine comme décrit ailleurs (Shevchenko et al., 2007), y compris des étapes de réduction et d'alkylation. Après une nuit d'incubation, les peptides générés ont été extraits et purifiés avec ZipTip C18 pointes de pipette (Millipore) et élué dans 35 l d'acétonitrile à 80 %-0,1 % d'acide trifluoroacétique. Les peptides élués ont été séchés, remis en suspension dans 15 l d'acétonitrile à 1 %-acide trifluoroacétique à 0,05 % et conservés à 4°C.

2.4 Analyse et traitement des digestions de protéines par LC-MS/MS

Les peptides résultant de la digestion trypsique ont été séparés par chromatographie liquide en phase inverse (UltiMate 3000 RSLCnano, Dionex) et analysés dans un LTQ Orbitrap XL MS couplé en ligne (Thermo Fisher Scientific). Environ 5 ul de solution peptidique ont été injectés dans une colonne de piégeage de 75 um x 2 cm (colonne LC à séparation rapide Acclaim PepMap Dionex) à 4 ul/min pendant 5,75 min. Par la suite, les peptides ont été séparés à 50 °C et à un débit de 175 nl/min sur une colonne de séparation de 50 µm × 25 cm (Acclaim PepMap RSLC Dionex) en appliquant un gradient de 90 min allant de 2,4 % à 32,0 % d'acétonitrile. Les peptides ont été ionisés à l'aide d'une ionisation nanospray et analysés par MS avec une dissociation induite par collision (CID) parmi les cinq premiers. Les scans d'enquête ont été acquis avec une résolution de 60 000 et des états de charge ≥ 2+ sélectionnés pour la fragmentation.

Le traitement des données par chromatographie liquide (LC)-MS/MS a été effectué en utilisant les séquences d'anticorps et l'algorithme Sequest intégré dans le Proteome Discoverer (version 1.4 Thermo Fisher Scientific). La recherche a été limitée aux peptides trypsiques. La tolérance de masse des précurseurs était de 5 ppm, la tolérance de masse des fragments de 0,5 Da, le taux de fausses découvertes a été fixé à 5 %. La méthionine oxydée a été autorisée en tant que modification dynamique. Par la suite, la couverture protéique et la surface ont été déterminées, qui sont appelées ici la couverture [%] des composants d'anticorps et la surface [%] des composants d'anticorps.

La couverture protéique décrit le pourcentage de la protéine qui est couverte par les peptides identifiés. Les aires de protéines sont la somme des aires sous les chromatogrammes d'ions extraits par correspondances de spectre de peptides (PSM) par peptide identifié pour la protéine identifiée.


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Une analyse protéomique réussie met l'accent sur la préparation des échantillons, l'instrumentation et le logiciel.

Une préparation correcte des échantillons signifie de meilleurs résultats

Les protéines d'intérêt pour les chercheurs en biologie sont généralement présentes dans un mélange complexe d'autres protéines, ce qui pose deux problèmes importants dans l'analyse de la SEP :

  1. Les techniques d'ionisation utilisées pour les grosses molécules fonctionnent bien lorsque le mélange contient des quantités à peu près égales de constituants. Cependant, la gamme dynamique des concentrations de protéines dans les échantillons biologiques peut dépasser 10 ordres de grandeur. Si un tel mélange est ionisé en utilisant l'ionisation par électrospray (ESI), par exemple, les espèces les plus abondantes ont tendance à "se noyer" ou à supprimer les signaux des espèces moins abondantes.
  2. Le spectre de masse d'un mélange complexe est très difficile à analyser complètement en raison de son nombre écrasant de composants. Ce problème est exacerbé par la digestion enzymatique d'un échantillon de protéine en un grand nombre de produits peptidiques. Le succès de la chromatographie liquide MS (LC-MS) et de la MS en tandem (LC-MS/MS) dépend d'échantillons propres avec une complexité d'échantillon limitée pour minimiser la suppression de l'ionisation par les espèces à forte abondance et empêcher le sous-échantillonnage MS des peptides éluants.

La préparation des protéines pour l'analyse MS peut être réalisée par de nombreuses méthodes, il est donc important de comprendre les étapes menant à l'analyse. Alors que les protéines intactes sont généralement étudiées par électrophorèse sur gel, les flux de travail de spectrométrie de masse les plus courants pour les échantillons de protéines complexes analysent les peptides, qui sont plus faciles à fractionner par LC que les protéines. Les peptides s'ionisent et se fragmentent également plus efficacement que les protéines entières, ce qui donne des spectres plus faciles à interpréter pour l'identification des protéines. La préparation des peptides implique la réduction et l'alkylation des cystéines, la digestion de l'échantillon en peptides, le dessalage et la concentration des peptides et l'analyse finale de ces peptides par ionisation (par exemple, ESI) plus MS à base d'orbitrap.

La décision d'utiliser MALDI-MS ou LC-MS ou LC-MS/MS pour l'analyse protéomique dépend d'un certain nombre de facteurs, notamment le niveau de préparation de l'échantillon et le potentiel de débit. Par exemple, étant donné que plusieurs échantillons peuvent être séchés sur une seule matrice MALDI, 96 échantillons peuvent être analysés en une heure par rapport à un seul échantillon par LC-MS ou LC-MS/MS. Inversement, toute réduction de la complexité de l'échantillon doit être effectuée hors ligne avec MALDI-MS, et donc la préparation de l'échantillon est considérablement plus critique pour cette approche que pour LC-MS ou LC-MS/MS, qui nécessite une préparation d'échantillon minimale en raison de l'in -Ligne LC en phase inversée utilisée pour réduire la complexité de l'échantillon avant l'analyse MS.

Workflow de préparation des échantillons. Les échantillons de lysat sont préparés à partir d'échantillons biologiques ou de cellules cultivées par un protocole personnalisé qui peut inclure la lyse cellulaire, le fractionnement subcellulaire, l'épuisement des protéines à forte abondance, l'enrichissement des protéines cibles, la dialyse et le dessalage. La digestion en solution implique la rupture irréversible des liaisons disulfure par réduction et alkylation suivie d'une digestion des protéines en fragments peptidiques. Une approche alternative consiste à d'abord résoudre les protéines par électrophorèse 1D ou 2D (1DE ou 2DE, respectivement), puis à collecter des tranches de gel contenant la ou les bandes souhaitées. Les protéines de ces bouchons de gel sont ensuite réduites, alkylées et digérées in situ. Une fois les peptides extraits de la matrice de gel, les peptides sont enrichis et les sels et détergents retirés et préparés pour l'analyse MS. Bien que ce diagramme englobe les étapes les plus courantes de la préparation des échantillons, le protocole doit être adapté à des échantillons spécifiques et à des techniques MS pour des résultats optimaux.

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Protocoles de digestion de la trypsine

Une spécificité stricte de l'activité de la trypsine est cruciale pour l'identification des protéines. Cependant, la spécificité peut être compromise par l'autolyse, qui génère de la pseudotrypsine avec une spécificité élargie et une activité de type chymotrypsine (Keil-Dlouha et al. 1971). L'autolyse peut entraîner des fragments peptidiques supplémentaires qui pourraient interférer avec l'analyse de la base de données et l'identification des protéines.

L'autolyse est supprimée par la méthylation réductrice des résidus de lysine, produisant une molécule très stable (Rice et al. 1977). Pour une spécificité maximale, Promega propose de la trypsine modifiée de qualité séquencée (Cat. # V5111 et V5117), qui subit une méthylation réductrice et un traitement TPCK pour améliorer la spécificité du clivage de la trypsine. TPCK inactive l'activité de la chymotrypsine. Pour améliorer encore l'efficacité protéolytique, Promega a développé une Trypsine Gold plus active, de qualité spectrométrie de masse (Cat. # V5280). Plus d'informations et un protocole détaillé sont disponibles dans le bulletin technique Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade # TB309.

Digestion de protéines en gel

De nombreux protocoles de digestion des protéines en gel existent (Flannery et al. 1989 Shevchenko et al. 1996 Rosenfeld et al. 1992). La procédure suivante a été utilisée avec succès par les scientifiques de Promega. Pour un protocole plus simplifié, voir le protocole pour la digestion en gel des protéines à l'aide de trypsine et de tensioactif ProteaseMAX™, Tryspin Enhancer dans le tensioactif ProteaseMAX™, Trypsin Enhancer, Bulletin technique #TB373.

Matériaux nécessaires:

  • Trypsine Gold, Grade Spectrometry de Masse (Cat.# V5280) et protocole
  • SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen Cat.# LC6060)
  • acide trifluoroacétique (TFA)
  • acétonitrile (ACN)
  • 200 mM NH4HCO3 tampon (pH 7,8)
  • 50 mM d'acide acétique
  • Eau NANOpure®
  • Pointes de pipette ZipTip® scx (Millipore Cat.# ZTSCXS096) ou pointes de pipette ZipTip® C18 (Millipore Cat.# ZTC18S096)
  • Microtubes à centrifuger de 0,5 ml prélavés deux fois avec 50 % d'ACN/0,1 % de TFA
  • Concentrateur Speed ​​Vac®
  1. Séparer les échantillons de protéines par électrophorèse sur un gel SDS-Tris-Glycine.
    Noter: D'autres systèmes de gel et réactifs de coloration peuvent être utilisés pour les digestions en gel, mais doivent être testés pour garantir la compatibilité avec la protéine d'intérêt et le système de détection utilisé.
  2. Rincer le gel pendant 5 minutes avec de l'eau NANOpure®. Répétez ce lavage deux fois pour un total de trois lavages. Colorer pendant 1 heure dans SimplyBlue™ SafeStain à température ambiante en agitant doucement. Une fois la coloration terminée, jetez la solution de coloration.
  3. Décolorer le gel pendant 1 heure dans de l'eau NANOpure® à température ambiante sous agitation douce. Une fois la décoloration terminée, jetez la solution.
  4. À l'aide d'une lame de rasoir propre, coupez les bandes de protéines d'intérêt du gel, en éliminant autant de polyacrylamide que possible. Placer les tranches de gel dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 ml prélavé deux fois avec 50 % d'ACN/0,1 % de TFA.
  5. Décolorer les tranches de gel avec 0,2 ml de 100 mM NH4HCO3/50 % ACN pendant 45 minutes à 37°C. Répétez cette étape de décoloration une fois.
  6. Déshydrater les tranches de gel pendant 5 minutes à température ambiante dans 100μl d'ACN 100%. Après déshydratation, les tranches de gel seront beaucoup plus petites que leur taille d'origine et auront un aspect blanchâtre ou opaque.
  7. Séchez les tranches de gel dans un concentrateur Speed ​​Vac® pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.
  8. Remettre en suspension la Trypsine Gold à 1μg/μl dans de l'acide acétique 50mM, puis diluer dans 40mM NH4HCO3/10% ACN à 20μg/ml. Préincuber les tranches de gel dans un volume minimal (10 à 20 µl) de solution de trypsine à température ambiante (ne pas dépasser 30 °C) pendant 1 heure. Les tranches se réhydrateront pendant ce temps. Si les tranches de gel apparaissent blanches ou opaques après une heure, ajoutez 10 à 20 μl supplémentaires de trypsine et incubez pendant une heure à température ambiante.
  9. Ajouter suffisamment de tampon de digestion (40 mM NH4HCO3/10% ACN) pour recouvrir complètement les tranches de gel. Boucher hermétiquement les tubes pour éviter l'évaporation. Incuber une nuit à 37°C.
  10. Incuber les tranches de gel avec 150μl d'eau NANOpure® pendant 10 minutes, en mélangeant fréquemment au vortex. Retirer et conserver le liquide dans un nouveau tube de microcentrifugation.
  11. Extraire la tranche de gel deux fois avec 50μl de 50% ACN/5% TFA (avec mélange) pendant 60 minutes à chaque fois à température ambiante.
  12. Regroupez tous les extraits (des étapes 10 et 11) et séchez dans un concentrateur Speed ​​Vac® à température ambiante pendant 2 à 4 heures (ne pas dépasser 30 °C).
  13. Purifiez et concentrez les peptides extraits à l'aide des pointes de pipette ZipTip® (Millipore Corporation) en suivant les instructions du fabricant.
  14. Les peptides élués des pointes ZipTip® sont maintenant prêts pour l'analyse par spectrométrie de masse.

Digestion de protéines en solution

Typiquement, les protéines sont réduites puis alkylées pour permettre un accès immédiat de la trypsine aux sites de clivage internes. Ceci garantit une couverture élevée des séquences de protéines pendant l'analyse par spectrométrie de masse (Wilkinson, 1986). Si une couverture de séquence élevée n'est pas requise, les étapes de réduction et d'alkylation peuvent être omises. Noter: Pour digérer une protéine non réduite, commencez ce protocole à l'étape 3.

  1. Dissoudre la protéine cible dans 8 M d'urée/50 mM de Tris-HCl (pH 8) [ou 50 mM de bicarbonate d'ammonium (pH 7,8)]/ 5 mM de DTT, et incuber à 37°C pendant 1 heure.
    Noter: La dénaturation des protéines avec du chlorure de guanidine (GuCl) n'est pas recommandée car même de faibles concentrations de GuCl inhibent la trypsine.
  2. Ajouter de l'iodoacétamide à une concentration finale de 15 mM et incuber pendant 30 minutes dans l'obscurité à température ambiante.
  3. Diluer la réaction avec trois volumes de Tris-HCl 50 mM (pH 8) [ou de bicarbonate d'ammonium 50 mM (pH 7,8)] pour réduire la concentration d'urée à 2 M. Pour la digestion des protéines natives, dissoudre la protéine dans 50 mM de NH4HCO3 (pH 7,8) ou Tris-HCl 50 mM (pH 8) sans urée.
  4. Ajouter Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, à un rapport final protéase:protéine de 1:100 à 1:20 (w/w). Incuber une nuit à 37°C.
  5. Terminer la digestion en ajoutant du TFA ou de l'acide formique à une concentration finale de 1% et analyser l'échantillon par chromatographie haute performance (HPLC) ou chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC/MS).

Trypsine Or, Protocole de Grade Spec de Masse

Plus d'informations et un protocole détaillé pour l'utilisation de Trypsin Gold, Mass Spec Grade sont disponibles dans le bulletin technique # TB309.

Test d'affinité in vitro Pull-Down avec digestion de la trypsine et analyse des protéines

Markillie et ses collègues ont décrit une méthode simple de purification et d'identification d'un complexe protéique exogène qui peut être facilement automatisée (Markillie et al. 2005). La méthode utilise des particules MagneHis™ Ni (Cat.# V8560, V8565) pour extraire les protéines cibles, suivies d'une élution dénaturante, d'une digestion trypsique et d'une analyse par spectrométrie de masse (Figure 2).

Figure 2. Diagramme schématique de l'étiquette d'affinité dans un essai de pull-down vitro avec digestion à la trypsine et analyse par spectrométrie de masse.

Mélange Trypsine/Lys-C, Grade Spec de Masse

Trypsine/Lys-C, Mass Spec Grade (Cat.# V5071), est une préparation de trypsine avec la plus haute efficacité protéolytique. C'est un mélange de Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, et de rLys-C, Mass Spec Grade. La protéolyse avec le mélange Trypsine/Lys-C, Mass Spec Grade, génère des peptides trypsiques (c'est-à-dire des peptides avec des résidus d'arginine et de lysine C-terminaux). Avec le protocole de digestion à la trypsine conventionnel (c'est-à-dire une incubation d'une nuit dans des conditions non dénaturantes), Trypsine/Lys-C Mix améliore la digestion des protéines en éliminant la majorité des clivages manqués (figure 3).

Figure 3. Comparaison côte à côte des sites de clivage manqués par la trypsine ou le mélange Trypsine/Lys-C à l'aide d'un protocole de digestion conventionnel

Les protéines étroitement repliées représentent un défi particulier, ces protéines sont résistantes à la protéolyse en raison de l'inaccessibilité des sites de clivage internes pour la trypsine. L'utilisation de Trypsine/Lys-C Mix aide à surmonter ce défi en activant un protocole de digestion en deux étapes (Figure 4), qui utilise la tolérance de la protéase Lys-C aux conditions de dénaturation des protéines. A l'étape 1, une protéine est dénaturée avec de l'urée 8M. Dans ces conditions, Lys-C reste actif et digère une protéine en fragments relativement gros. Dans la deuxième étape, le mélange de digestion est dilué quatre fois pour réduire la concentration d'urée à 2M. Cela réactive la trypsine et permet une protéolyse complète.

Figure 4. Digestion de protéines difficiles à digérer à l'aide d'une procédure spécialisée en deux étapes avec Trypsine/Lys-C Mix.

Protocole Trypsine/Lys C

Plus d'informations et de détails sur le protocole sont disponibles dans le Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade, Technical Manual #TM390.


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T1 - Préparation de protéines et de peptides pour l'analyse par spectrométrie de masse dans un workflow protéomique ascendant

N2 - Cette unité décrit les étapes nécessaires pour préparer un échantillon pour l'analyse MS après séparation ou enrichissement des protéines par électrophorèse sur gel, chromatographie liquide et capture par affinité dans le contexte d'un flux de travail protéomique ascendant dans lequel la protéine est d'abord divisée en peptides , soit par digestion chimique ou enzymatique, avant analyse MS. Sont également inclus des protocoles d'enrichissement au niveau des peptides, y compris l'enrichissement en phosphopeptides et la chromatographie en phase inversée pour la purification des échantillons immédiatement avant l'analyse MS. Enfin, il y a une discussion concernant les types de technologies MS couramment utilisées pour analyser les échantillons protéomiques, ainsi que les paramètres importants qui doivent être pris en compte lors de l'analyse des données MS pour assurer des identifications et une caractérisation rigoureuses et robustes des protéines.

AB - Cette unité décrit les étapes nécessaires pour préparer un échantillon pour l'analyse MS après séparation ou enrichissement des protéines par électrophorèse sur gel, chromatographie liquide et capture par affinité dans le contexte d'un flux de travail protéomique ascendant dans lequel la protéine est d'abord décomposée en peptides , soit par digestion chimique ou enzymatique, avant analyse MS. Sont également inclus des protocoles d'enrichissement au niveau des peptides, y compris l'enrichissement en phosphopeptides et la chromatographie en phase inversée pour la purification des échantillons immédiatement avant l'analyse MS. Enfin, il y a une discussion concernant les types de technologies MS couramment utilisées pour analyser les échantillons protéomiques, ainsi que les paramètres importants qui doivent être pris en compte lors de l'analyse des données MS pour assurer des identifications et une caractérisation rigoureuses et robustes des protéines.


Présentation de la discussion

La spectrométrie de masse est un outil puissant pour élucider la composition élémentaire d'un échantillon ou d'une molécule. Plus récemment, il a été utilisé pour caractériser du matériel biologique, en particulier des protéines et des complexes protéiques, dans une variété d'organismes. Dans cette conférence, nous passerons en revue les principes sous-jacents du fonctionnement d'un spectromètre de masse, discuterons de l'instrumentation à jour qui est actuellement utilisée dans le cadre de la recherche biologique et fournirons des exemples spécifiques de la façon dont la spectrométrie de masse est utilisée pour révéler un aperçu fonctionnel de différents facteurs biologiques. systèmes.


CONCLUSIONS

L'utilisation de la SM était à l'origine limitée à l'étude des isotopes élémentaires. Cependant, à mesure que l'instrumentation, la technologie informatique et les logiciels associés se sont améliorés, la gamme d'applications MS s'est élargie. La grande variété de types d'échantillons qui peuvent maintenant être analysés, et l'étendue des informations qui peuvent être obtenues, ont aidé MS à pénétrer dans un large éventail de domaines de recherche. Le résultat est que la SEP est devenue un outil analytique essentiel dans la recherche biologique.


Voir la vidéo: Applications de la spectrométrie de masse V2 (Janvier 2022).