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Comment s'y prendrait-on pour identifier les protéines inconnues des points de contrôle du cycle cellulaire (c'est-à-dire les cyclines) ?

Comment s'y prendrait-on pour identifier les protéines inconnues des points de contrôle du cycle cellulaire (c'est-à-dire les cyclines) ?


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Non, ce n'est pas des « devoirs ». Je suis étudiant au doctorat, et c'est quelque chose qui a été soulevé à la fin d'un club de lecture récemment, et l'un des IP a posé cette question et nous a dit d'y réfléchir. Cela semble simple, mais cela m'a en quelque sorte déconcerté.

  • Transfert occidental : Non. Besoin d'un antigène connu et donc, puisque nous ne savons pas ce que nous recherchons, cela ne fonctionnera pas.

  • Gel protéiné total : Recueillez les lysats cellulaires de différentes populations cellulaires qui se trouvent dans différentes parties du cycle cellulaire, exécutez-le sur un gel et observez toute expression cyclique. Cela semble en quelque sorte ok, mais j'ai l'impression qu'il y a quelques problèmes avec cela : 1) identifier les populations cellulaires qui sont dans les différentes étapes du cycle ; 2) d'autres protéines de taille identique/similaire qui ne peuvent pas être différenciées.

  • Une sorte d'ARNi, knockdown, etc. : Comme le western blot, nous ne savons pas à quoi nous avons affaire et ne pouvons donc rien cibler.

  • Essai pulldown avec spec de masse : Je n'y connais pas grand-chose à part le fait qu'il examine les interactions protéine-protéine. Je ne sais pas si ce serait approprié ici.

En tant que modèle, je pensais à une levure ou à une lignée cellulaire de mammifère immortalisée.


J'ai en fait été impliqué dans une chasse aux protéines de point de contrôle chez les diatomées (un type d'algues eucaryotes), la famille des cyclines s'est considérablement élargie dans ces organismes et nous essayions de comprendre ce que ces cyclines supplémentaires détectaient/signalaient[1].

En bref, le premier auteur a examiné différentes conditions susceptibles d'affecter l'expression de la cycline. La plupart de ces conditions ont empêché la division cellulaire (par exemple, manque de nutriments, d'inhibiteurs chimiques G2/M ou de lumière) et des échantillons ont été prélevés avant et après la suppression des conditions de blocage. Ensuite, les ARNm ont été quantifiés des gènes suspectés du cycle cellulaire. Étant donné que l'ARNm et les protéines des gènes du point de contrôle cyclent de manière extrêmement transitoire, cela a demandé du temps. Les cyclines qui ont réagi aux conditions ont été caractérisées à l'aide d'essais de complémentation et d'autres techniques.

Ensuite, deux tests hybrides sur levure ont été utilisés pour identifier les protéines en interaction pour construire le réseau[2]. En général, ces expériences n'étaient pas si simples et jouer avec les gènes essentiels cause beaucoup de problèmes, mais ce n'est toujours rien comparé au travail original sur les cyclines de levure où ils se frayaient un chemin à travers des montagnes de mutants thermosensibles défectueux dans leur cycle cellulaire (voir les travaux de Lee Hartwell et Paul Nurse qui a obtenu le prix Nobel pour cela en 2001 avec Tim Hunt).


Voir la vidéo: la mitose (Décembre 2022).