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Structure des anticorps RAP (spécifiquement RAP-5)


[ÉDITER] - Je viens de trouver non pas un mais deux articles qui traitent de mon problème de structure. Cependant, ils concernent RAP-1A, donc je suppose que ma question est maintenant quelle est la différence de structure et de fonction de RAP-1A et RAP-5 ? Est-ce que quelqu'un sait que l'analyse de la structure aux rayons X est utilisée pour examiner RAP-5 ?


Question originale

Je suis un étudiant en physique à l'université et j'écris un faux article de critique sur ce que je ressens comme un anticorps très «non physique» - RAP-5.

Bien que ma connaissance de la biologie soit assez pauvre, la recherche se déroule plutôt bien. J'ai trouvé beaucoup d'articles des années 80 sur la conduite d'expériences d'immunohisto(/cyto)chimie, la plupart d'entre eux trouvant que RAP-5 peut être utilisé pour déterminer si une cellule contient le ras, afin qu'ils soient capables de mesurer le pourcentage de cellules néoplasiques (je crois que cela signifie cancéreuses) et contenant du ras et le pourcentage de cellules normales et contenant du ras. (le gène ras étant un proto-oncogène qui, lors d'une mutation, peut entraîner une activation permanente des protéines ras (p21?), ce qui entraîne une prolifération de cellules et peut donc provoquer des tumeurs). Tout cela est très joli, mais à première vue, l'immunohistochimie ne semble pas impliquer une énorme quantité de physique (pour mon devoir de biophysique), à ​​part l'utilisation d'un microscope optique.

J'espérais pouvoir concentrer une section de mon article sur les techniques physiques impliquées dans la détermination de la structure de RAP-5. Bien qu'il semble y avoir beaucoup de littérature sur les utilisations de RAP-5, j'ai du mal à trouver quoi que ce soit sur les détails sur les raisons pour lesquelles il peut être utilisé dans de telles expériences. En d'autres termes, je suppose que sa fonction est de se lier à un épitode spécifique de la protéine ras (les acides aminés 10 -17 sont apparus quelques fois) mais je ne sais pas s'il existe une imagerie que l'on puisse faire pour avoir un regard sur la structure et la conclusion « oui c'est pourquoi elle se lie aux protéines ras et pas aux autres ». Existe-t-il une technique susceptible d'avoir été utilisée pour examiner la structure de RAP-5 ? Est-ce que sa structure tertiaire est susceptible d'être en forme de « Y » comme d'autres anticorps ? Sa structure diffère-t-elle de RAP1-4 ? (ce livre m'informe que RAP1 et RAP2 ont 60% d'identité de séquence, mais la plupart des sources semblent laisser de côté RAP3-to-5, me disant un soir que la famille RAP se compose de RAP1A/B, RAP2A/B/C et aucun autre !).

De plus, si RAP-5 est un anticorps, cela signifie-t-il qu'il est produit dans le corps et s'implique dans la voie du signal de la protéine ras afin de réduire trop l'expression de ras ? (Ai-je raison de dire que la quantité d'expression est la quantité de protéine produite par le gène ras ?)

De plus, il semble y avoir peu de différenciation entre les différences dans les fonctions de chaque PAR. RAP-5 semble être assez utilisé dans les expériences impliquant Ha-ras - mais pas exclusivement. Les différents RAP se lient-ils à différentes variantes de ras ? Ha-ras étant le seul à RAP-5.


La confusion à laquelle vous êtes confronté est due au fait que RAP-5 est en fait connu sous le nom de RAB5C (GENEID). La superfamille ras (revue) est divisée en Ras, Rho, Rab et Rap. Mais les Rap GTPases ne sont divisées qu'en deux catégories, RAP1 et RAP2. D'autre part, il existe plusieurs Rab GTPases qui incluent RAB5A et RAB5C.

Il existe quelques structures cristallines de Rab5A et de Rab5C sous forme humaine et murine.

Maintenant, pour RAP-5. RAP-5 est un anticorps murin monoclonal qui n'a aucune relation avec la famille de protéines RAP. Cela s'appelle probablement RAP parce que Spandidos et Wilkie ne pensaient pas clairement lorsqu'ils ont nommé leurs anticorps RAP1-5. Dans ce cas, vous feriez probablement mieux de regarder l'anticorps Y13-259 qui s'appelle probablement ainsi puisque c'est le 259e anticorps qu'ils ont essayé.

Pour répondre précisément à vos questions, très peu de personnes ont tenté d'obtenir une structure puisqu'il s'agit d'un anticorps et que tout le monde sait à quoi il ressemble. Deuxièmement, l'anticorps est produit chez une souris et ajouté au tissu. Et oui, les anticorps RAP se lient à différentes variantes de Ras. De plus, personne n'utilise le RAP-5 puisque l'anti-Ras EP1125Y semble être plus populaire.

Si vous voulez toujours une structure cristalline, je traquerais le brevet RAP5 et chercherais la séquence peptidique. De là, vous pouvez rechercher des structures similaires dans la base de données IMGT


Composition et structure des acides nucléiques : ADN et ARN

Lisez cet article pour en savoir plus sur la composition et la structure des acides nucléiques : ADN et ARN !

Il existe deux grandes classes d'acides nucléiques : l'ADN et l'ARN.

Les deux sont composés de chaînes d'unités non ramifiées appelées nucléotides, chacune contenant :

(1) Une base azotée (soit une purine soit une pyrimidine),

Dans l'ARN, le pentose est le ribose, alors que dans l'ADN, il s'agit du 2-désoxyribose. L'ADN et l'ARN contiennent tous deux les bases azotées puriques adénine (en abrégé A) et guanine (G) et la pyrimidine cytosine (C), mais dans l'ADN une seconde pyrimidine est la thymine (T), tandis que dans l'ARN, c'est l'uracile (U).

Un certain nombre d'autres bases azotées ont été identifiées dans l'ADN et l'ARN, mais elles sont beaucoup moins fréquentes. Le composant acide phosphorique de chaque nucléotide est, bien entendu, chimiquement identique dans les deux acides nucléiques. Ces relations sont résumées dans le tableau 7-1, et les formules chimiques correspondantes sont présentées dans la figure 7-3.

Le pentose de chaque unité nucléotidique est lié simultanément par son atome de carbone numéro 1 à la base azotée (formant un nucléoside) et par son atome de carbone numéro 5 à l'acide phosphorique. Les structures des quatre désoxyribonucléotides de l'ADN ainsi que le système de numérotation spécifique utilisé pour identifier chaque atome constitutif sont illustrés à la figure 7-4. Les nucléotides successifs de l'ADN et de l'ARN sont reliés entre eux par des liaisons phosphodiester impliquant le groupe 5′-phosphate d'une unité nucléotidique et le groupe 3′-hvdroxyl de l'unité voisine (Figure 7-5).

L'épine dorsale d'une molécule d'acide nucléique est formée par la séquence répétitive de groupes pentose et phosphate, et c'est la même chose dans toutes les molécules. Ce qui distingue une molécule d'ADN (ou d'ARN) d'une autre, c'est la séquence spécifique de bases puriques et pyrimidiques présentes dans la chaîne de nucléotides et le nombre total de nucléotides (c'est-à-dire la taille de la molécule). Chaque chaîne de nucléotides est appelée un polynucléotide.

Structure de l'ADN:

À un moment donné, on croyait que les quatre purines et pyrimidines de l'ADN se trouvaient en quantités approximativement égales dans la molécule. Cependant, les études de E, Chargaff et d'autres à la fin des années 1940 ont montré que ce n'était pas le cas. Au lieu de cela, ils ont constaté que les quantités relatives des bases azotées variaient entre les espèces mais étaient constantes au sein d'une espèce.

La constance notée au sein d'une espèce a été maintenue quel que soit le tissu ou l'organe à partir duquel l'ADN a été isolé. De plus, les quantités relatives des bases azotées étaient similaires chez les espèces étroitement apparentées et très différentes chez les espèces non apparentées.

Chargaff a également fait la conclusion extrêmement importante suivante. Quelle que soit l'espèce utilisée comme source d'ADN, les rapports molaires de l'adénine et de la thymine étaient toujours très proches de l'unité, et il en était de même pour la guanine et la cytosine. Aucune relation constante de ce type n'a pu être démontrée pour toute autre combinaison de paires de bases azotées. Cela impliquait que pour une raison quelconque, chaque molécule d'ADN contenait des quantités égales d'adénine et de thymine et également des quantités égales de guanine et de cytosine.

En utilisant des informations chimiques de ce type, ainsi que les résultats d'études cristallographiques aux rayons X de l'ADN, J. D. Watson, F. H. C. Crick, M. H. F. Wilkins et R. Franklin ont proposé un modèle pour la structure de l'ADN au début des années 1950. Ils ont suggéré qu'une molécule d'ADN se compose de deux chaînes polynucléotidiques hélicoïdales enroulées autour d'un axe commun pour former une "double hélice" à droite.

Contrairement à la disposition des chaînes latérales d'acides aminés dans les polypeptides hélicoïdaux (où les chaînes latérales sont dirigées radialement loin de l'axe de l'hélice), les bases puriques et pyrimidiques de chaque chaîne polynucléotidique étaient dirigées vers l'intérieur vers le centre de la double hélice de sorte qu'elles face à face.

Sur la base d'études stéréochimiques, Watson et Crick ont ​​en outre suggéré que le seul arrangement possible des bases azotées au sein de la double hélice qui était compatible avec ses dimensions prédites était celui dans lequel une purine faisait toujours face à une pyrimidine, pour la distance diamétrale entre les deux chaînes polynucléotidiques sont trop petites pour accueillir deux purines juxtaposées.

Quelle purine correspondait à quelle pyrimidine est devenue claire en considérant quelles paires seraient capables de former les liaisons hydrogène nécessaires pour stabiliser la structure en double hélice. En conséquence, Watson et Crick ont ​​conclu que l'adénine doit être associée à la thymine et la guanine à la cytosine.

Cette conclusion était, bien sûr, en accord avec les découvertes chimiques de Chargaff (voir ci-dessus) - en fait, les données de Chargaff peuvent avoir été essentielles au développement des propositions de Watson et Crick. La manière dont les liaisons hydrogène se forment entre l'adénine et la thymine et entre la guanine et la cytosine est illustrée à la figure 7-6.

Bien qu'individuellement faibles, le grand nombre de ces liaisons contribue sensiblement à la stabilité de la structure en double hélice. De plus, la double hélice est stabilisée par des liaisons hydrophobes entre les bases azotées voisines de chaque chaîne polynucléotidique. Certaines autres caractéristiques de la structure de l'ADN doivent être notées.

Les deux chaînes polynucléotidiques qui composent la molécule sont antiparallèles. C'est-à-dire qu'en commençant à une extrémité de la molécule et en progressant vers l'autre, les nucléotides successifs d'une chaîne sont réunis par des liaisons phosphodiester 3’→5′, tandis que les nucléotides complémentaires de l'autre chaîne sont joints par 5’→ 3 & 8242 liaisons phosphodiester. Cette disposition antiparallèle est représentée schématiquement sur la figure 7-7.

L'ADN droitier à double hélice peut exister sous l'une des deux formes principales : celles-ci sont appelées ADN-A et ADN-B. Les deux formes diffèrent principalement par le positionnement des bases azotées autour de l'axe de la double hélice et par le nombre de bases par tour d'hélice. Dans l'ADN-B, il y a 10 paires de bases par tour d'hélice, chaque tour balayant 3,4 nm (34 A) de traduction linéaire (voir Fig. 7-8) dans l'ADN-A, il y a 11 bases par tour d'hélice, chaque tour balayant 2,8 nm (28 A) de translation linéaire.

Ainsi dans la forme A, la double hélice a un diamètre plus important. Dans l'ADN-B, les bases complémentaires se trouvent dans un plan perpendiculaire à l'axe de l'hélice, tandis que dans l'ADN-A, les plans des paires de bases successives sont inclinés par rapport à l'axe de l'hélice. On pense que c'est la forme B de l'ADN qui prédomine dans les cellules, bien que la forme A puisse exister dans les hybrides ADN-ARN.

Les deux polynucléotides sont entortillés l'un autour de l'autre de manière à produire deux sillons hélicoïdaux à la surface de la molécule, appelés sillons majeur et mineur (Fig. 7-8). Le fond du sillon principal est tapissé d'atomes d'oxygène et d'azote qui pourraient former des liaisons hydrogène avec les chaînes latérales d'acides aminés des protéines.

En effet, c'est l'association de protéines spécifiques avec l'ADN qui serait impliquée dans la régulation de l'expression des gènes. On pense que l'interaction des molécules d'eau avec les atomes tapissant le fond du petit sillon contribue à la stabilité de la forme B.

Réplication de l'ADN:

L'une des propriétés intrinsèques du matériel génétique est sa capacité de réplication. La manière dont l'ADN satisfait à cette exigence ressort de l'appariement des bases azotées requis dans le modèle. Étant donné que la séquence de bases dans une chaîne polynucléotidique détermine automatiquement la séquence de bases dans l'autre, il est clair que la moitié d'une molécule (c'est-à-dire l'une des deux hélices) contient toutes les informations nécessaires à la construction d'une molécule entière.

Par exemple, si nous savons que la séquence de bases le long d'une chaîne polynucléotidique d'ADN est A T G A C, et ainsi de suite, alors la séquence complémentaire dans l'autre chaîne doit être T A C T G, et ainsi de suite. Par conséquent, si la double hélice était déroulée, chaque chaîne polynucléotidique distincte pourrait servir de matrice pour la production d'une nouvelle chaîne complémentaire.

Le résultat serait deux doubles hélices identiques là où il n'y en avait qu'une auparavant. Bien entendu, la moitié de chaque nouvelle double hélice serait représentée par l'une des chaînes polynucléotidiques d'origine. Les caractéristiques de base de ce processus sont illustrées aux figures 7-9 et 7-10. Une description détaillée du mécanisme par lequel la réplication de l'ADN se produit, ainsi que sa base expérimentale.

Dénaturation et renaturation de l'ADN:

L'ADN est facilement dénaturé par les extrêmes de température et de pH. La dénaturation prend la forme d'un déroulement de la double hélice au fur et à mesure que les liaisons hydrogène entre bases complémentaires sont rompues. Cette forme de dénaturation de l'ADN est appelée fusion et produit des brins d'ADN séparés. Les solutions d'ADN absorbent la lumière ultraviolette (UVL) ayant une longueur d'onde de 260 nm. Lorsque la température d'une solution native d'ADN est élevée, la fusion résultante s'accompagne d'une augmentation de l'absorption des UVL.

Cet effet hyperchrome se produit parce que les purines et les pyrimidines des brins séparés peuvent absorber plus d'énergie lumineuse que lorsqu'elles font partie d'une double hélice. Certains virus contiennent une forme d'ADN simple brin (voir plus loin), et comme cette forme ne présente pas l'effet hyperchrome, elle se distingue facilement des formes double brin.

Lorsque l'ADN est fondu thermiquement, la dénaturation commence dans les régions de la double hélice riches en paires de bases A-T et se déplace progressivement vers des régions de plus en plus riches en G-C. En effet, les deux liaisons hydrogène qui maintiennent chaque paire A-T ensemble peuvent être rompues plus facilement (donc à une température plus basse) que les trois liaisons hydrogène qui maintiennent chaque paire G-C ensemble. Une mesure quantitative du changement d'absorbance UVL qui se produit lorsque la température d'une solution d'ADN augmente lentement est appelée courbe de fusion (Fig. 7-11).

Le point de la courbe de fusion auquel le passage de l'ADN double brin à l'ADN simple brin est à moitié terminé est appelé le Tm valeur et est caractéristique d'une source particulière d'ADN. La spécificité d'espèce caractéristique des courbes de fusion de l'ADN reflète les différences dans les compositions G-C et A-T de différents types d'ADN (Fig. 7-12).

L'ADN dénaturé thermiquement peut être renaturé en abaissant la température de la solution, grâce à quoi les brins séparés se recombinent pour former des doubles hélices tandis que les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires se reforment. Ce ré-annelage peut être suivi comme une diminution de l'absorption UVL par la solution d'ADN. La capacité de réhybridation de l'ADN dénaturé peut être utilisée pour évaluer la taille du génome d'un organisme et la complexité de l'ADN présent.

Lorsque des études de réhybridation doivent être effectuées, l'ADN isolé est d'abord rompu par cisaillement en longueurs de plusieurs centaines à plusieurs milliers de paires de nucléotides. L'ADN en double hélice est ensuite dénaturé thermiquement pour donner des brins simples. Une concentration connue de l'ADN simple brin est ensuite incubée à la température de réhybridation (généralement environ 25° en dessous de la Tm) et le taux de recuit est déterminé à partir du taux de variation de l'absorbance UVL.

Un grand génome se rehybride plus lentement qu'un petit génome car il y a un plus grand nombre et une plus grande variété de fragments d'ADN. Ainsi, chaque fragment prend plus de temps pour « rechercher » et se recuire avec son partenaire complémentaire. La cinétique de renaturation de l'ADN (Fig. 7-12) est représentée par une courbe reliant le pourcentage de fragments réassociés au “C0nombre t” (c'est-à-dire la concentration d'ADN en moles de nucléotides par litre (C0) multiplié par le temps de réaction (t) en secondes).

Comme le montre la figure 7-12, l'ADN viral (courbe c) se réhybride plus rapidement que l'ADN procaryote (courbe d), et ce dernier se réhybride plus rapidement que l'ADN eucaryote (courbe e). La découverte d'une fraction d'ADN eucaryote dans des cellules de mammifères qui se re-hybride rapidement de manière inattendue (courbe b) a révélé pour la première fois l'existence dans les génomes d'organismes supérieurs de séquences d'ADN répétitives.

Sur la figure 7-12, la courbe montre la vitesse de réannelage d'une solution contenant un mélange d'acide polyuridylique produit synthétiquement (une chaîne nucléotidique avec uniquement des bases uracile) et de brins d'acide polyadénylique. Même si l'uracile ne se trouve généralement pas dans l'ADN, comme la thymine, il peut former des liaisons hydrogène avec l'adénine et le fait dans de nombreuses molécules d'ARN (voir ci-dessous).

Pendant environ 25 ans après l'établissement initial du modèle Watson – Crick de la structure de l'ADN, il a été présumé que tout l'ADN à double hélice naturel était droitier. Cependant, en 1979, A. Rich a confirmé des observations antérieures rapportées par F. M. Pohl et T. Jovin qu'une forme d'ADN gaucher existe également. Comme dans l'ADN droitier, les deux hélices sont maintenues ensemble par un appariement de bases complémentaires et les brins sont antiparallèles. Parce que les squelettes sucre-phosphate des deux polynucléotides tracent un parcours en zigzag autour de l'axe des hélices (Fig. 7-13), cet ADN gaucher a été appelé ADN-Z.

Bien que la structure de l'ADN-Z proposée à l'origine par Rich ait été basée sur des études de cristaux d'ADN produits en laboratoire, l'ADN-Z a depuis été identifié dans les chromosomes d'un certain nombre de cellules eucaryotes. Une variété de preuves indirectes implique également que l'ADN-Z est un constituant normal des cellules animales, des cellules végétales et des bactéries. Contrairement à l'ADN-B, l'ADN-B est hautement immunogène, ce qui permet de produire facilement des anticorps contre l'ADN-Z. La réaction de ces anticorps avec l'ADN isolé d'une variété de types cellulaires implique la présence de la forme Z. Des protéines de liaison à l'ADN-Z d'origine naturelle ont également été isolées à partir d'un certain nombre de cellules.

La forme Z de l'ADN semble coexister avec la forme B dans les mêmes molécules d'ADN. En effet, on pense que l'ADN peut basculer entre les formes B et Z dans les régions d'une double hélice riches en séquences alternant purines et pyrimidines. Ces séquences semblent se produire dans des régions sélectives de l'ADN d'une cellule, ce qui donne du crédit à l'idée que les changements d'hélicité de l'ADN entre les formes droitières et gauchers peuvent être impliqués dans l'expression sélective des gènes.

“ADN monobrin”:

Bien que dans presque tous les cas étudiés jusqu'à présent, l'ADN consiste en deux chaînes polynucléotidiques enroulées l'une sur l'autre pour former une double hélice, il est maintenant évident que dans quelques virus bactériens (c'est-à-dire les phages X 174 et S13 E. coli) l'ADN existe sous la forme d'une seule chaîne polynucléotidique.Cela a d'abord été suspecté lorsque les analyses chimiques des teneurs en bases azotées de ces ADN viraux ont révélé que les quantités d'adénine et de thymine, ainsi que de guanine et de cytosine, n'étaient pas égales.

Au cours de la reproduction de ces virus, l'ADN simple brin (appelé brin « 8221 + ») est injecté dans la cellule bactérienne hôte, où il agit comme une matrice pour la reproduction d'une chaîne polynucléotidique complémentaire (appelée le & #8220-brin”) ces deux polynucléotides se combinent pour former une double hélice conventionnelle, qui sert ensuite de matrice pour la production de brins + supplémentaires. Les brins + nouvellement produits sont ensuite enfermés dans les enveloppes de protéines virales pour former de nouvelles particules virales.

Structure de l'ARN:

L'ARN et l'ADN diffèrent chimiquement de deux manières notables : dans l'ARN, le ribose est le pentose (pas le désoxyribose comme dans l'ADN) et l'uracile pyrimidine se produit à la place de la thymine (Fig. 7-14). Les premières analyses chimiques des teneurs en bases azotées des ARN provenant de diverses sources ont révélé que les rapports molaires A:U et G:C étaient assez différents des rapports molaires A:T et G:C de l'ADN. Sur cette base, il a été conclu que l'ARN se présente sous la forme d'une seule chaîne polynucléotidique.

Cette affirmation est également étayée par des études physico-chimiques, mais il convient de noter qu'il existe certains ARN viraux qui sont double brin. Bien qu'une seule chaîne polynucléotidique soit généralement présente, l'ARN possède des régions d'enroulement en double hélice où la chaîne unique se boucle sur elle-même.

Ces régions sont stabilisées par la formation de liaisons hydrophobes entre bases voisines (comme dans l'ADN) et également par la formation de liaisons hydrogène entre la guanine et la cytosine et entre l'adénine et l'uracile.

Dans l'ARN, A et U peuvent former deux liaisons hydrogène similaires aux deux liaisons formées entre A et T dans l'ADN. Comme dans l'ADN, les portions du brin d'ARN qui sont enroulées les unes autour des autres pour former une double hélice sont antiparallèles. Dans l'ARN à double hélice, les hélices et les paires de bases complémentaires sont arrangées de la même manière que dans l'ADN-A.

Synthèse d'ARN:

Sauf peut-être dans le cas de la reproduction de certains virus à ARN, la synthèse de l'ARN semble être dirigée par l'ADN et est appelée transcription. La formation du polynucléotide d'ARN a lieu en utilisant la séquence de bases le long d'une seule des deux hélices désoxyribonucléotidiques de l'ADN (produisant un hybride ARN-ADN temporaire) comme matrice et entraîne la libération d'une seule chaîne polyribonucléotidique complémentaire dans laquelle la base l'uracile remplace la thymine (figure 7-14).

Réplication des virus à ADN et à ARN:

Les virus peuvent être divisés en deux classes : les virus dont le complément génétique est constitué d'ADN et les virus dont le complément génétique est constitué d'ARN. Dans les cellules infectées par des virus à ADN, l'ADN viral infectant est répliqué, formant un nouvel ADN viral qui est ensuite transcrit en ARN, cet ARN est ensuite traduit en protéine virale (Fig. 7-15a).

L'ADN viral et les protéines virales nouvellement produits se combinent dans l'assemblage de nouvelles particules virales complètes qui sont libérées lors de la lyse de la cellule hôte. Un état latent peut également être établi dans lequel l'ADN viral est incorporé dans le génome de la cellule hôte, étant répliqué et distribué avec l'ADN natif de la cellule hôte, jusqu'à ce qu'il soit à nouveau transcrit en ARN viral supplémentaire, puis en ARN viral. protéines.

Pour la plupart des virus à ARN (par exemple, la poliomyélite, la grippe, le rhume, etc.), l'implication de l'ADN est essentiellement contournée. Par exemple, lors de l'infection d'une cellule par le poliovirus, l'ARN simple brin (appelé brin +) pénètre dans la cellule hôte, où il agit comme une matrice pour la synthèse de brins complémentaires –. Ces derniers sont ensuite employés dans la prolifération de nouveaux brins + et ceux-ci sont traduits en protéines virales (Fig. 7-15b).

Le mécanisme décrit ci-dessus est varié dans plusieurs autres virus dans lesquels l'ARN est soit à double brin (par exemple, les réovirus, dans lesquels un seul des deux brins d'ARN produits lors de la réplication est transcrit) ou le brin d'ARN simple infectant est complémentaire (plutôt qu'identique ) aux ARN viraux nouvellement produits qui doivent être traduits en protéines virales (par exemple, le virus de Sendai, le virus de la maladie de Newcastle, etc.)

Encore un autre mécanisme existe dans le cas des virus tumoraux à ARN (par exemple, le virus du sarcome de Rous). Ces virus ne transfèrent pas d'informations d'ARN à ARN, mais plutôt d'ARN à ADN puis à un nouvel ARN. L'ARN viral est utilisé comme matrice pour la synthèse d'ADN par la cellule infectée (un phénomène appelé « transcription inverse »). Une partie de "l'ADN viral" résultant peut être incorporée dans le génome de la cellule hôte, établissant ce que l'on appelle l'état du provirus.

L'état de provirus a été suggéré comme la base d'un certain nombre de cancers induits par des virus à ARN et à ADN différents. Selon ce point de vue, un ou plusieurs gènes du provirus - qui sont normalement réprimés par la cellule hôte - peuvent devenir déréprimés et provoquer la production d'une substance oncogène (c'est-à-dire cancérigène) qui modifie les propriétés ou le comportement normaux de la cellule. . Un tel changement peut être retardé de plusieurs générations, en fonction de la période de latence.

Au cours des années 1960 et au début des années 1970, le soi-disant « dogme central » de la biologie moléculaire était le flux ordonné et unidirectionnel d'informations codées dans les séquences de bases de l'ADN d'une cellule à l'ARN puis à la protéine, c'est-à-dire

La découverte de la transcription inverse par certains virus à ARN dans lesquels l'information de l'ARN est transmise à l'ADN a nécessité un réexamen de ce dogme et a soulevé la question de savoir si une interaction similaire entre l'ARN et l'ADN pourrait normalement se produire dans les cellules (c'est-à-dire les cellules non infectés par des virus) dans des conditions spécifiques (par exemple, au cours de la différenciation cellulaire). Le dogme central pourrait être représenté de manière plus appropriée comme,

Types d'ARN cellulaire :

Les cellules contiennent trois principaux types fonctionnels d'ARN : l'ARN ribosomique (ARNr abrégé), l'ARN messager (ARNm) et l'ARN de transfert (ARNt). Tous ces éléments sont transcrits à partir de l'ADN et interviennent dans la médiation de l'expression du message génétique de l'ADN en participant à la synthèse des protéines cellulaires. Il a déjà été noté que l'ARN sert occasionnellement de matériel génétique de virus.

Parmi les ARN cellulaires, l'ARNr est le plus abondant, représentant jusqu'à 85 % de l'ARN total de la cellule. Seuls trois ou quatre types différents d'ARNr sont présents dans les cellules, et ceux-ci sont confinés pour la plupart aux ribosomes cellulaires. L'ARNm représente environ 5 à 10 % de l'ARN cellulaire et est beaucoup plus hétérogène en termes de taille et de teneur en bases azotées que les ARNr.

Ceci résulte de la relation (voir ci-dessous) entre les longueurs de chaîne et les séquences de bases des ARNm et les tailles variables et les structures primaires des polypeptides synthétisés dans une cellule. La plupart des ARNm se produisent dans le cytoplasme, où ils se combinent de manière transitoire avec les ribosomes au cours de la synthèse des protéines.

Environ 10 à 20 % de l'ARN cellulaire est de l'ARNt. Toutes les molécules d'ARNt sont de taille similaire et contiennent généralement 75 unités nucléotidiques. Malgré ces similitudes, une seule cellule peut contenir environ 60 espèces d'ARNt différant par leurs séquences de bases. Étant donné que la plupart de l'ARNt est récupéré dans la phase cytoplasmique (c'est-à-dire soluble) des cellules perturbées après centrifugation, l'ARNt est également appelé ARN soluble (c'est-à-dire ARNs).

Compte tenu de sa petite taille et de sa relative facilité d'isolement, l'ARNt a été plus largement étudié que les deux autres acides ribonucléiques, et les structures primaires, secondaires et tertiaires spécifiques de nombreux ARNt ont déjà été déterminées. Les ARNt contiennent des quantités modérées de nucléotides inhabituels tels que la ribothymidine, la dihydrouridine, la pseudouridine et la méthylguanosine. Ceux-ci sont formés par modification des quatre bases d'ARN communes après que l'ARNt a été synthétisé à partir des quatre ribonucléotides non modifiés. Les bases modifiées jouent un rôle crucial dans l'établissement de l'organisation spatiale unique de ces molécules.

Bien que les mécanismes de la réplication de l'ADN et de la synthèse des protéines soient examinés en profondeur, il est approprié qu'un bref compte rendu des relations fonctionnelles entre les acides nucléiques et entre les acides nucléiques et les protéines soit fait à ce stade. Les informations héréditaires sont codées dans les différentes séquences de bases azotées que possède l'ADN de la cellule, et par le processus de transcription et de traduction, ces séquences de bases sont utilisées pour spécifier les structures primaires de toutes les protéines, produites par la cellule.

Les plus importantes parmi ces protéines sont les enzymes qui catalysent et régulent la myriade de réactions chimiques caractérisant le métabolisme cellulaire. Par conséquent, l'information de l'ADN confinée essentiellement au noyau cellulaire se manifeste principalement dans le cytoplasme comme la synthèse d'un assemblage unique de protéines.

La réplication de l'ADN qui précède la division cellulaire mitotique et la répartition égale de l'ADN dupliqué parmi les cellules de la descendance permettent le passage d'ensembles complets d'informations d'une génération de cellules à une autre. En plus de servir de matrices pour leur propre réplication, les séquences nucléotidiques d'ADN sont utilisées pendant la transcription pour produire des séquences de bases complémentaires d'ARN.

Les ARN résultants servent alors d'intermédiaires pour traduire le message original en protéine. Les molécules d'ARNm dont les séquences de bases déterminent directement les structures primaires des polypeptides sont d'une importance primordiale dans ce processus. Ces molécules d'ARNm quittent le noyau de la cellule suite à leur synthèse et se fixent dans le cytoplasme à un (ou plusieurs) ribosome.

On pense que l'ARNr de chaque ribosome joue un rôle dans cet attachement. Les molécules d'ARNt également produites dans le noyau pénètrent dans le cytoplasme, où elles se combinent avec des acides aminés spécialement activés (des ARNt distincts existent pour chaque espèce d'acide aminé). Les complexes résultants, dirigés par la séquence de bases de l'ARNm attaché aux ribosomes, déposent séquentiellement leurs acides aminés dans les chaînes polypeptidiques en croissance.


Introduction

La superfamille Ras des GTPases monomères contrôle un large éventail de processus cellulaires. Le membre prototypique de cette classe de molécules régulatrices, Ras, joue un rôle dans 30% des cancers humains. Rap1 est un membre du sous-ensemble des GTPases monomères les plus étroitement liées à Ras lui-même. Alors que les fonctions biologiques de Ras, en particulier ses rôles dans la croissance et la différenciation cellulaires, sont bien établies, les fonctions de Rap1 sont mal comprises. Décrit à l'origine comme un suppresseur de la transformation oncogène induite par Ras (Kitayama et al., 1989), un modèle soutenait que Rap1 fonctionnait en rivalisant pour les effecteurs Ras, une opinion étayée par la capacité de Rap1 à se lier à Raf-1 mais à pas activer la cascade MAPK (Bos, 1998). Ce point de vue a perdu du crédit lorsqu'il a été rapporté que Rap1 peut stimuler MAPK via B-Raf (Vossler et al., 1997) et que Rap1 surexprimé était capable d'induire une transformation oncogène dans les fibroblastes 3T3 suisses (Altschuler et Ribeiro-Neto, 1998). D'autres effecteurs Ras qui favorisent la croissance cellulaire (par exemple, RalGDS) sont également activés par interaction avec Rap1 (Kishida et al., 1997).

Le contrôle de la croissance n'est qu'un des nombreux processus dans lesquels Rap1 a été impliqué. Le facteur d'échange de nucléotides de guanine (GEF) Rap1 Epac2 a été lié à l'exocytose régulée par l'AMPc, impliquant Rap dans le contrôle du trafic vésiculaire (Ozaki et al., 2000). La surexpression de Rap1 a stimulé l'adhésion dépendante de l'intégrine des cellules T humaines, et l'adhésion des cellules T a été bloquée par l'expression de Rap1 dominant-négatif (Reedquist et al., 2000). Particulièrement illustrative des fonctions distinctes de Ras et Rap est la découverte récente que ces GTPases ont des effets opposés sur le trafic des récepteurs AMPA (Zhu et al., 2002).

La recherche des fonctions de Rap1 a inclus des analyses chez les eucaryotes inférieurs. Bud1, un Saccharomyces cerevisiae l'orthologue de Rap1, est critique pour l'établissement de la polarité de la levure par l'assemblage du cytosquelette d'actine pendant la formation des bourgeons (Park et al., 1999). Dans Dictyostelium discoideum, l'ébouriffage de la membrane et la formation de lamellipodes, deux changements morphologiques basés sur l'actine, ont été régulés par Rap1 (Rebstein et al., 1997). Dans Drosophila melanogaster, la distribution des jonctions adhérentes dans l'épithélium est contrôlée par un orthologue de Rap1 (Knox et Brown, 2002).

Les fonctions distinctes de Ras et Rap1 suggèrent qu'en dépit d'une identité de séquence de 70 % dans la région de liaison effectrice, y compris une identité complète parmi les résidus montrés pour entrer en contact avec le domaine de liaison Ras (RBD) des effecteurs (Bos et al., 2001), ces GTPases sont régulés de manière différentielle. En effet, bien que certains GEF soient partagés entre Ras et Rap1 (par exemple, Ras-GRP2), d'autres sont spécifiques à Rap1 (par exemple, C3G Bos et al., 2001). Une fois chargée en GTP, la modulation de l'état de liaison des nucléotides diffère entre Ras et Rap car, contrairement à Ras et à la plupart des GTPases liées à Ras qui ont un résidu glutamine en position 61, Rap1 a une thréonine et donc une activité GTPase intrinsèque très faible. En plus de cette différence intrinsèque, des protéines activatrices de GTPase (GAP) spécifiques de Rapl ont été décrites précédemment (Polakis et al., 1991). Malgré les similitudes des domaines effecteurs de Ras et Rap1, en particulier dans le domaine switch 1, les affinités relatives pour les effecteurs diffèrent considérablement, peut-être en raison de différences dans le domaine switch 2. Par exemple, alors que le RBD de Raf-1 se lie à Ras avec une affinité 50 fois plus élevée qu'à Rap1, l'inverse est vrai pour le RBD de RalGDS (Herrmann et al., 1996).

Ras et Rap1 diffèrent également par leurs régions hypervariables COOH-terminales qui dirigent la modification post-traductionnelle et le ciblage membranaire. Alors que les protéines Ras sont modifiées avec un isoprénoïde farnésyl, Rap1 est modifiée avec un lipide géranylgéranyl. Conformément à leurs motifs distincts de ciblage membranaire, les localisations subcellulaires de Ras et Rap1 ont été signalées comme différentes, une caractéristique qui pourrait expliquer, en partie, la fonction différentielle. Dans les cellules myéloïdes primaires, Rap1, mais pas Ras, est associé à des compartiments vésiculaires spécialisés qui servent de pools de membrane qui peuvent être rapidement mobilisés à la surface cellulaire lors de la dégranulation (Maridoneau-Parini et de Gunzburg, 1992 Mollinedo et al., 1993 Berger et al., 1994). L'analyse par immunofluorescence indirecte de fibroblastes et de cellules épithéliales cultivées a révélé Rap1 dans la région de Golgi (Beranger et al., 1991) et sur les endosomes (Pizon et al., 1994) mais pas sur la membrane plasmique (PM). En revanche, dans les mêmes cellules, les protéines Ras sont exprimées à l'état d'équilibre à la fois sur l'appareil PM et l'appareil de Golgi (Choy et al., 1999). Il a été démontré que Rap1, comme Ras, subit un échange GTP/GDP en réponse à divers facteurs de croissance (Zwartkruis et al., 1998). À l'aide d'une sonde fluorescente, nous avons récemment déterminé que les pools de PM et de Golgi de Ras sont activés en conséquence de la signalisation du facteur de croissance (Chiu et al., 2002). Des travaux récents ont examiné la localisation subcellulaire de la signalisation Rap en utilisant un capteur GTPase à base de FRET chimérique, Raichu-Rap1 (Mochizuki et al., 2001 Ohba et al., 2003). Malgré son ciblage sur les PM avec la région hypervariable de K-Ras4B, cette sonde a signalé l'activation de Rap1 sur les endomembranes dans les cellules vivantes stimulées par l'EGF.

En analysant les protéines Rap1 marquées par GFP dans des cellules vivantes et en localisant Rap1 endogène à l'aide d'un fractionnement subcellulaire, nous avons constaté que la localisation à l'état d'équilibre de Rap1 inclut les endosomes et le PM mais pas l'appareil de Golgi, que la localisation des PM dépendait de la liaison au GTP, et que les facteurs de croissance stimulaient une augmentation rapide de l'expression de Rap1 sur les PM qui dépendait de l'exocytose. En fusionnant GFP au RBD de RalGDS (GFP-RBDRalGDS), nous avons développé une sonde spécifique à Rap1 qui nous a permis de déterminer où et quand Rap1 est activé dans les cellules vivantes. Nous avons constaté que, contrairement à Ras (Chiu et al., 2002), seul le pool de Rap1 associé aux PM s'activait en réponse à des facteurs de croissance. Des résultats similaires ont été obtenus dans les cellules T dans lesquelles l'adhésion médiée par Rap1 a été bloquée par l'inhibition de l'exocytose.


Bien que de nombreuses études biochimiques et structurelles aient démontré que des séquences d'ADN contenant des séquences de guanines adjacentes se replient spontanément dans des structures d'ADN G-quadruplex in vitro, ce n'est que récemment que les preuves de leur présence et de leur fonction ont commencé à s'accumuler en vieo. Des analyses à l'échelle du génome ont révélé que les régions génomiques fonctionnelles d'organismes très divergents sont enrichies en séquences d'ADN avec un potentiel de formation de G-quadruplexes, suggérant que les G-quadruplexes pourraient fournir un mécanisme basé sur les acides nucléiques pour réguler la maintenance des télomères, ainsi que la transcription , la réplication et la traduction. Ici, nous passons en revue les études récentes visant à découvrir les in vivo présence et fonction des G-quadruplexes dans les génomes et l'ARN, avec un accent particulier sur les G-quadruplexes télomériques et comment leur formation et leur résolution sont régulées pour permettre la synthèse des télomères.

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Le facteur critique de la voie de signalisation de l'AMPc

L'AMPc, également connu sous le nom d'adénosine cyclique 3,5-monophosphate, régule les processus physiologiques essentiels, notamment le métabolisme, la sécrétion, l'homéostasie du calcium, la contraction musculaire, le destin cellulaire et la transcription des gènes. L'AMPc est un nucléotide cyclique qui sert de second messager vital dans plusieurs voies de signalisation.

Les niveaux intracellulaires d'AMPc sont régulés par l'équilibre entre les activités de deux enzymes : l'adénylyl cyclase (AC) et la nucléotide cyclique phosphodiestérase (PDE). Différentes isoformes de ces enzymes sont codées par un grand nombre de gènes, qui diffèrent par leurs modèles d'expression et leurs mécanismes de régulation, générant des réponses spécifiques au type cellulaire et au stimulus.


Méthodes

Culture de cellules

Des cellules ES de souris V6.5 ont été cultivées sur des plaques recouvertes de gélatine à 0,2% à 37 ° C avec un milieu mES : 500 ml de Knockout DMEM (Gibco), 90 ml de FBS, 6 ml d'acide aminé non essentiel (NEAA, 100 ×, Gibco) , 6 ml de glutamine ou glutamax (solution mère 200 mM), 6 ml de Pen/Strep, 1 ml de BME et 60 lLIF (Millipore, ESG1106). Des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été cultivées à 37 °C et 5 % de CO2 dans 450 ml de DMEM, 50 ml de FBS, 5 ml de Pen/Strep, 5 ml de NEAA, 5 ml de pyruvate et 4 l de bêta-mercaptoéthanol. Des cellules de précurseurs neuraux de souris (NPC) ont été cultivées dans du milieu N2B27 (DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033), Neurobasal (Gibco, 21103-049), NDiff Neuro-2 Medium Supplement (Millipore, SCM012), Supplément B27 (Gibco, 17504-044)) additionné d'EGF et de FGF (10 ng/ml, chacun) (315-09 et 100-18B, Peprotech). Les cellules ont été passées à l'aide d'Accutase (SCR005, Millipore) et cultivées sur des plaques recouvertes de gélatine à 0,2 %. Des cellules souches embryonnaires humaines H9 ont été ensemencées dans un système sans mangeoire à l'aide de Matrigel HESC-Qualified Matrix (354277, Corning) et ont été maintenus dans des milieux Essential 8 (A1517001, Thermo Fisher Scientific) comme décrit précédemment [69]. Les cellules ont été repiquées tous les 3 jours sous forme de touffes avec 0,5 mM d'EDTA. Des fibroblastes humains femelles (HFF) ont été cultivés à 37 °C et 5 % de CO2 dans du DMEM additionné de 1 % de stylo/streptocoque et de 10 % de FBS.

Préparation de la bibliothèque PIRCh-seq

Pour récolter les cellules pour PIRCh-seq, environ 4 × 107 cellules ont été trypsinisées et regroupées dans un tube Falcon de 50 ml, après avoir été lavées une fois avec 40 ml de PBS froid. Du glutaraldéhyde frais à 1 % dans du PBS à température ambiante a été créé à partir de 25 % de stock, et le stock restant a été jeté. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1 ml de solution de glutaraldéhyde, et une pipette p1000 a été utilisée pour remettre en suspension les cellules et compléter jusqu'à 40 ml (1 ml de glutaraldéhyde à 1 %/1 million de cellules). Après plusieurs inversions, le tube a été agité doucement pendant 10 min, puis trempé avec 1/10 de volume de glycine 1,25 M. Le tube a été inversé plusieurs fois, secoué doucement pendant 5 min et centrifugé 2000g pendant 4 minutes. Le culot a ensuite été lavé une fois avec 40 ml de PBS froid. Le culot a été répondu dans 1 ml/20 millions de cellules de PBS froid. Les cellules ont été aliquotées à 1 ml chacune dans un tube Eppendorf frais et centrifugées à 2000g pendant 4 minutes. Après avoir soigneusement aspiré le surnageant, les culots cellulaires ont été congelés rapidement et stockés à - 80 °C si nécessaire.

Pour la sonication, les culots cellulaires préparés ont été centrifugés à 2000g pendant 4 min et tout PBS restant a été éliminé. La lyse pour 20 millions de cellules a été réalisée avec 1 ml de tampon de lyse (1% SDS, 50 mM Tris 7.0, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 U/μl Superase-in (Ambion), 1 × inhibiteur de protéinase (Roche)) . Le lysat a ensuite été soniqué jusqu'à ce que la taille de la chromatine soit

300–2000 pb et le lysat était clair. Nous avons utilisé l'équipement Covaris E220 avec les paramètres suivants : niveau de remplissage 10, cycle de service 15, PIP 140 et cycles/rafale 200. En termes de temps, nous avons soniqué des impulsions de 20 minutes pour tester le temps optimal pour générer la taille de la chromatine

300–2000 pb. Les lysats ont été centrifugés à 16 000g pendant 10 minutes. Les surnageants ont été congelés rapidement et conservés à - 80 °C si nécessaire.

Pour la construction de la bibliothèque PIRCh-seq, la chromatine a été décongelée et 10 ul ont été pris en entrée. Deux cents microlitres ont été aliquotés par réaction et 400 pi de tampon de dilution ont été ajoutés à chaque réaction. H3 ou un anticorps spécifique de modification des histones a ensuite été ajouté (tampon de dilution : 0,01 % SDS, 1,1 % Triton X 100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris 7,0, 167 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0,1 U/μl Superase-in (Ambion ), 1 × inhibiteur de la protéinase (Roche)). La réaction a été secouée bout à bout à 4°C pendant une nuit. Cinquante microlitres de billes de protéine A ont été utilisés pour 5 µg d'anticorps IP. Les billes ont été lavées avec 5 fois le volume initial de tampon de dilution 4 fois. Notez qu'il est important de ne pas dépasser 200 ul de volume d'origine de billes par tube. Lors du dernier lavage, les billes ont été aliquotées dans 1 tube par réaction. Le tampon a été aspiré et 200 pi de l'échantillon IP ont été utilisés pour remettre en suspension et transférer les billes dans l'échantillon IP. La réaction a été agitée bout à bout à température ambiante pendant 2 h. Les billes ont ensuite été lavées avec 1 ml de tampon de lavage 4 fois et remises en suspension dans 50 pi de tampon d'élution IP (1% SDS, 50 mM NaHC03). La réaction a ensuite été vortexée au réglage 1 pendant 15 min. Le surnageant a ensuite été transféré dans un nouveau tube et l'élution des billes a été répétée. Le surnageant a été combiné pour un total de 100 µl. Cinq microlitres de NaOAc 3 M ont été immédiatement ajoutés pour neutraliser le pH. Dix microlitres de tampon TurboDnase et 1 ul de TurboDnase (Ambion) ont été ajoutés et la réaction a été incubée à 37°C pendant 30 min. Trois microlitres d'EDTA 500 mM ont été ajoutés pour éliminer les ions divalents. Cinq microlitres de protéinase K (Ambion) ont été ajoutés et la réaction a été incubée à 50 °C pendant 45 min.

Pour fabriquer nos bibliothèques de séquençage, nous avons extrait l'ARN à l'aide de Trizol/chloroforme et précipité l'ARN avec un volume égal d'isopropanol. Le culot d'ARN a été lavé dans 1 ml d'EtOH à 70 %, et les culots ont été remis en suspension dans 10 pi de H20. Un microlitre de tampon TurboDnase a été ajouté, suivi par 1 ul de TurboDnase, et la réaction à 37°C pendant 30 min. 1,2 µl de réactifs d'inactivation TurboDnase ont été ajoutés. La réaction a été vortexée pendant 3 min et centrifugée. Le surnageant de 10 pi a été chauffé à 75 °C pendant 10 min pour tuer la DNase. La réaction a été purifiée à l'aide d'un kit Nugen Ovation v2 et éluée dans 5 l pour la préparation de la bibliothèque.

Préparation de la bibliothèque ChIRP-seq

Pour déterminer la localisation à l'échelle du génome de lnc-Nr2f11, nous avons suivi les protocoles précédemment décrits [33]. ChIRP a été réalisée en utilisant des sondes biotinylées conçues contre lnc-Nr2f1 de souris en utilisant le concepteur de sondes ChIRP (Biosearch Technologies). Des pools de sondes indépendants pairs et impairs ont été utilisés pour assurer la récupération spécifique de l'ARNnc comme les protocoles décrits précédemment [25]. Les ensembles de sondes « pairs » et « impairs » ne partageaient pas de séquences se chevauchant, car nous avons effectué deux expériences ChIRP-seq indépendantes avec ces deux ensembles de sondes séparément. Deux ensembles de données ont ensuite été combinés pour une analyse en aval (voir ci-dessous). Des échantillons de souris NPC sont réticulés dans du formaldéhyde à 3 %. Les échantillons prétraités à la RNase servent de témoins négatifs pour l'hybridation sonde-ADN. Les bibliothèques ChIRP sont construites à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN NEBNext (New England Biolabs). Les bibliothèques de séquençage ont été codées à barres à l'aide d'adaptateurs TruSeq et séquencées sur des instruments HiSeq ou NextSeq (Illumina).

Validation expérimentale de la spécificité des anticorps après réticulation au glutaraldéhyde à l'aide de mononucléosomes modifiés avec codes-barres

Pour garantir que la réticulation chimique avec le glutaraldéhyde n'affecte pas la spécificité des anticorps, nous avons suivi une étude précédente pour tester la spécificité des anticorps à l'aide de SNAP-ChIP [26]. Pendant le pulldown IP, 15 ul de nucléosomes recombinants (SNAP-ChIP, EpiCypher, 19-1001) ont été fixés avec du glutaraldéhyde frais à 1 %. Un pour cent de glutaraldéhyde a été préparé le même jour dans du PBS à température ambiante à partir de 25 % de stock. La fixation a été effectuée pendant 10 min à température ambiante sous agitation douce. La réaction a ensuite été désactivée avec 1/10 du volume de réaction d'origine de 2,5 M de glycine. Les tubes ont ensuite été inversés plusieurs fois et incubés pendant 5 minutes à température ambiante sous agitation douce.

Cinq cents microlitres de chromatine fixée ont ensuite été ajoutés à chaque tube et pipetés de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger. Dix microlitres de nucléosomes mélangés à de la chromatine ont été retirés de chaque tube pour être utilisés comme entrée lors de la qPCR. Un comprimé d'inhibiteur de protéase complet Roche a été dissous (Roche, 11697498001) dans 50 ml d'eau DI pour obtenir une solution de travail d'un cocktail d'inhibiteur de protéase 50x. Soixante microlitres d'inhibiteur de protéase 50X ont été ajoutés à 3 ml de tampon de dilution à blanc (0,01 % de SDS, 1,1 % de Triton X100, 1,2 mM d'EDTA, 16,7 mM de Tris pH 7,0, 167 mM de NaCl). Un millilitre de tampon de dilution avec un inhibiteur de protéase a ensuite été ajouté à chaque réaction. Cinq microgrammes d'anticorps de détection appropriés pour le pulldown IP ont été ajoutés à 300 ul de chromatine mélangée à des nucléosomes réticulés pour chaque condition. Les échantillons ont ensuite été incubés à 4 °C pendant une nuit avec agitation de bout en bout.

Le produit IP a été élué comme spécifié pendant la construction de la bibliothèque PIRCH. L'ADN d'intérêt a été purifié en utilisant un kit Zymo DNA Clean and Concentrator-5 (Zymo Research, D4013). La réaction qPCR a été réalisée à l'aide du LightCycler et du Brilliant II SYBR® Green QRT-PCR Master Mix de Roche (Agilent). Nous avons analysé l'enrichissement pour les modifications des histones cibles en amplifiant des codes-barres d'ADN uniques à l'extrémité 3', en utilisant des séquences d'amorces fournies par EpiCypher.

RT-qPCR

Pour l'analyse qRT-PCR, nous avons utilisé le LightCycler de Roche et le Brilliant II SYBR® Green QRT-PCR Master Mix (Agilent).

Alignement des données PIRCh-seq

Les lectures brutes ont été mappées de manière unique sur mm9/hg19 en utilisant Tophat avec les paramètres par défaut [70]. Samtools et BedTools ont été utilisés pour transformer le fichier bam mappé en fichiers bedGraph et bigwig pour une visualisation sur le navigateur de génome UCSC [71, 72]. Le RPKM et le nombre de lectures brutes pour chaque gène ont été calculés par des scripts auto-conçus avec une annotation d'ensemble, Homo_sapiens.GRCh37.75.gtf pour l'humain et Mus_musculus.NCBIM37.67.gtf, et un certain nombre de publications précédentes pour des échantillons de souris, respectivement [73 ]. Les comptes de lecture PIRCh-seq dans chaque échantillon ont ensuite été normalisés comme si la profondeur totale de séquençage était de 10 millions.

Calculer le rapport exon/intron pour estimer les transcrits naissants

Pour comparer les rapports exon/intron entre les profils PIRCh-seq et d'autres technologies de détection d'ARN associé à la chromatine, nous avons aligné les lectures brutes sur le même index du génome hg19 avec Tophat et calculé les lectures mappées sur intron/exon avec le fichier gtf d'annotation d'ensemble comme décrit ci-dessus [70]. Pour le nombre moyen de lectures autour des introns, trois étapes ont été suivies : (1) mis à l'échelle chaque intron en fonction de sa longueur, et étendu 1 longueur d'exon en amont et en aval de l'intron sélectionné (2) a divisé la région entière à 300 fenêtres, et calcule le nombre moyen de comptes de lecture mappés dans chaque fenêtre, puis prendre log2 pour réduire les valeurs afin d'éviter les interférences des valeurs aberrantes et (3) prendre la moyenne pour toutes les fenêtres parmi tous les introns. Pour estimer la corrélation entre le profil PIRCh-seq spécifique à la modification des histones et ses signaux ChIP-seq correspondants, nous avons obtenu des profils ChIP-seq de chaque modification d'histone dans mESC à partir d'ENCODE. Et puis, pour chaque gène exprimé dans mESC, le signal ChIP-seq de modification d'histone sur l'entrée sur l'exon du gène a été calculé comme le signal ChIP pour ce gène, et a été comparé au score d'enrichissement PRICh-seq correspondant avec la même modification d'histone, et nos résultats ont indiqué qu'il n'y avait pas de corrélation significative avec ces deux ensembles de signaux.

Analyse d'enrichissement du jeu de gènes

Le logiciel GSEA a été téléchargé à partir de (http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp) sur le site Web du Broad Institute et a été utilisé pour effectuer l'enrichissement différentiel significatif de la chromatine à partir de PIRCh-seq contre l'ARNnc par rapport aux gènes codants [42]. L'ensemble d'ARNnc se composait du snoARN annoté, du snRNA, de l'ARNr, du lncRNA, du miARN et du miscRNA.

Normalisation des données et identification des ARN enrichis en chromatine

Les ARNnc enrichis en chromatine ont été identifiés par l'algorithme de limma dans R [41]. Tout d'abord, une matrice de données a été obtenue, où chaque lecture brute était un gène et chaque colonne un échantillon, et l'élément de la matrice représentait le nombre de lectures brutes à partir des expériences et des entrées PIRCh-seq. Pour filtrer le gène à faible expression, la méthode "filterByExpr" dans edgeR [40] a été appliquée comme le recommande l'algorithme de limma. Les valeurs filtrées dans cette matrice ont ensuite été normalisées par la méthode limma-voom dans R. Après cela, une analyse différentielle a été effectuée à l'aide du modèle linéaire limma par gène pour chaque paire de répliques PIRCh sur les entrées. ARN non codants avec P la valeur< 0,05 et le changement de log2 par rapport aux entrées > 0 ont été définis comme étant enrichis en chromatine. Nous avons obtenu 258 ARNnc enrichis en chromatine dans la lignée cellulaire V6.5 de souris, 200 dans le MEF et 110 dans le NPC. Le score de variation de chaque gène a été défini comme les écarts types du changement de pli parmi tous les profils PIRCh-seq spécifiques à la modification des histones. Les coefficients de corrélation de Pearson entre chacune des deux expériences PIRCh-seq ont été calculés et un regroupement non supervisé de la matrice de corrélation a été effectué en cluster.

Validation informatique des ARNnc enrichis en PIRCh-seq

Afin de valider les candidats enrichis en PIRCh par des méthodes similaires, nous avons examiné 96 ensembles de données d'association de chromatine publiés à partir d'expériences ChIRP/CHART/RAP/GRID-seq collectées par la base de données LnChrom [43]. Nous avons trouvé un total de 23 lncRNAs exprimés dans la base de données LnChrom, y compris Xist, Feu, Rmrp, et Remorqueur1, et tous ont été positivement enrichis dans notre expérience PIRCh et 14 d'entre eux étaient significatifs avec P valeur< 0,05, suggérant la haute sensibilité de l'approche PIRCh dans l'identification des lncRNA associés à la chromatine. De plus, nous avons obtenu les sites de liaison génomique (pics) de 23 lncRNAs à partir des expériences susmentionnées, et les avons chevauchés avec les pics d'histone ChIP-seq [37] et avons obtenu un rapport de chevauchement pour chaque lncRNA. Nous avons ensuite calculé les coefficients de corrélation de Spearman de ces rapports avec leurs scores d'enrichissement PIRCh-seq de lncRNA correspondants dans la même lignée cellulaire (normalisés par le nombre total de pics différents de ChIP-seq), et avons constaté que ces corrélations étaient significativement plus élevées que les permutations aléatoires. L'appel de pointe a été effectué par MACS2 [74] avec FDR < 0.05.

Les états d'association de la chromatine des ARNnc enrichis

Pour regrouper les ARNnc enrichis en chromatine dans des groupes distincts pour la prédiction fonctionnelle, nous avons effectué t-SNE et K-signifie le regroupement sur la matrice de score d'enrichissement PIRCh avec les ARNnc associés à la chromatine. Le bon K numéro (K = 6) a été déterminé par le score de silhouette [49].

Comparaison de l'expression des gènes codants à proximité

Pour évaluer davantage la prédiction fonctionnelle des ARNnc enrichis en chromatine, nous avons d'abord regroupé les ARNnc enrichis en chromatine par classification fonctionnelle, puis obtenu des listes des gènes codants à proximité (± 100 Kb). Nous avons ensuite calculé les expressions géniques de ces gènes codants et les avons représentées dans des boîtes à moustaches. De même, nous avons obtenu une liste différente de gènes codants à proximité si les ARNnc enrichis en chromatine étaient classés en fonction de leurs scores d'enrichissement en chromatine sur chaque modification d'histone. La significativité entre chaque groupe a été estimée par la méthode bilatérale de Welch. T test.

Analyse lnc-Nr2f1 ChIPR-seq

Pour valider davantage les candidats PIRCh-seq, nous avons effectué ChIRP-seq sur l'un des lncRNAs enrichis en PIRCh-seq modifiés par H3K4me3 nommés lnc-Nr2f1. Des méthodes expérimentales ont été mentionnées ci-dessus, où des ensembles de sondes « pairs » et « impairs » indépendants ont été appliqués. LncARN lnc-Nr2f1 Les données ChIRP-seq ont ensuite été analysées en appliquant un pipeline précédemment publié [25], où l'alignement de lecture a été effectué dans bowtie2 et l'appel de crête dans MACS2. Les signaux des profils ChIRP-seq pairs et impairs ont ensuite été fusionnés pour réduire les faux positifs causés par les sondes. Nous avons confirmé que lnc-Nr2f1-les régions génomiques associées étaient en effet enrichies avec H3K4me3 mais aucune autre modification dans les NPC, où les données NPC ChIP-seq ont été obtenues à partir de GSE117289, indiquant la haute spécificité de notre approche PIRCh-seq.

Analyse d'enrichissement allélique spécifique dans NPC

Nous avons d'abord construit le génome de référence CAST/EiJ et 129S1/SvImJ. Les fichiers vcf contenant les SNP des souches CAST et 129S1 ont été téléchargés depuis la base de données dbSNP avec l'assemblage mm9 [75]. Leur fichier fasta de génome correspondant a été créé par la boîte à outils GATK FastaAlternateReferenceMaker et les outils SelectVariants [76]. Après cela, les entrées et les données PIRCh-seq ont été réalignées par rapport aux index CAST et 129S1 par TopHat2 avec 0 mésappariement (paramètre -N 0) pour améliorer la spécificité [70]. Les fichiers d'alignement spécifiques aux allèles ont ensuite été convertis au format bedGraph et bigWigs à l'aide de BEDtools. Pour chaque gène, son analyse d'expression et d'enrichissement spécifique à l'allèle a été réalisée pour chaque SNP de la liste et a estimé la signification entre CAST et 129S1 grâce au test de Mann-Whitney-Wilcoxon, et P la valeur < 0,05 a été définie comme significative.

Appels de pointe enrichis à partir des profils PIRCh-seq

Pour étudier plus avant le mécanisme sous-jacent de l'association ARN-chromatine, nous avons effectué des appels de pointe sur les profils PIRCh-seq pour identifier les bases de chaque ARN enrichi qui étaient principalement affiliées aux protéines histones. Nous avons d'abord fusionné les données de deux réplicats de chaque gène pour minimiser le biais de déviation expérimentale et lissé les nombres de lectures normalisés sur chaque base à travers une fenêtre coulissante de 5 pb, ainsi qu'un pas de 2 pb. L'appel de pointe a été effectué sur le signal lissé avec un script maison. Nous avons défini un pic dans le maximum local qui est cinq fois ou plus amplifié par rapport aux comptes de lecture médians du transcrit. Ensuite, nous avons appliqué une méthode de bootstrap en échantillonnant au hasard 1000 fois avec des lectures à partir des transcriptions, puis nous avons estimé le P valeur de chaque pic comme le pourcentage de cas qui étaient plus enrichis qu'observés. Enfin, nous avons calculé le changement de pli relatif de chaque pic par rapport au contrôle d'entrée. Les pics significatifs ont été filtrés en fonction du changement de pli et P valeur. Enfin, les informations de structure et de modification de l'ARN ont été intégrées aux pics PIRCh-seq pour une analyse en aval.

Analyse icSHAPE et prédiction structurelle à l'aide de RNAfold

Pour estimer les informations de structure autour du pic PIRCh, nous intégrons les données icSHAPE de souris V6.5 de l'article précédent [61, 65]. Le score icSHAPE de chaque transcription a été calculé par le pipeline icSHAPE d'origine avec le paramètre par défaut. Nous avons utilisé un script maison pour compter le score icSHAPE autour du pic PIRCh (± 200 pb) parmi tous les transcrits, et la signification entre le pic PIRCh de modification des histones et la région de fond aléatoire a été estimée par le système bilatéral de Welch. T test. En terme de Gaz5 dans NPC, les informations de structure de l'allèle 129S1 étaient représentées par les données icSHAPE V6.5, car elles ont la même séquence. La prédiction de la structure de l'allèle 129S1 et de l'allèle CAST a été réalisée par le serveur Web RNAfold avec le paramètre par défaut [62]. Pour l'allèle 129S1, le score icSHAPE plus élevé dans la région du pic indique une structure simple brin, qui est similaire à la prédiction de structure à partir de l'ARNfold. De plus, la prédiction de la structure de l'allèle CAST de Gaz5 dans NPC montre que les riboSnitches autour du pic PIRCh pourraient être la cause de l'enrichissement spécifique de l'allèle de Gaz5s en PNJ.

Statistiques

Pour les données présentées sur la figure 1b (RT-PCR), P les valeurs ont été calculées via le test de Mann-Whitney-Wilcoxon en Python. Pour les données présentées dans la figure 2d et le fichier supplémentaire 1 : figure S6B (GSEA), score d'enrichissement, P et FDR ont été calculés dans GSEA. Pour les données présentées dans le Fichier complémentaire 1 : Figure S2G, binôme P les valeurs ont été calculées par GREAT. Pour tous T test présenté dans cet article, y compris Fig. 2e, f, i Fig. 3f Fichier supplémentaire 1 : Figure S5C et Fig. 5d–g, P les valeurs ont été calculées via le système de Welch bilatéral T tester en Python. Pour les données présentées dans la figure 4f, P les valeurs ont été calculées par le test du chi carré.


Domaines de programme de recherche

La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d'imagerie du corps entier hautement sensible basée sur la détection du rayonnement de la désintégration d'une sonde radioactive ("traceur") administrée au patient. Contrairement à d'autres types d'imagerie qui imagent principalement la structure du corps, la TEP peut mesurer avec sensibilité le taux de processus biochimiques particuliers, notamment l'activité métabolique, la signalisation cellulaire, la réplication de l'ADN, la prolifération cellulaire, l'expression des gènes, etc., en fonction du traceur particulier administré. En clinique, la TEP est utilisée pour diagnostiquer, localiser et classer le cancer, surveiller l'efficacité de la chimiothérapie et effectuer des scintigraphies osseuses diagnostiques. Il peut également être utilisé pour diagnostiquer les troubles cardiaques et de santé mentale, suivre la progression des médicaments ou des toxines dans le corps et surveiller les processus de maladies infectieuses. La TEP est également largement utilisée dans la recherche sur les maladies et le développement de médicaments.

Malgré l'utilité et le potentiel de la TEP, la recherche est entravée par l'incapacité d'acquérir la plupart des traceurs à un coût raisonnable. Avec les technologies actuelles, le coût de production monte en flèche en raison du besoin d'infrastructures spécialisées en radioprotection (par exemple, des cellules chaudes), d'équipements de synthèse automatisés, d'équipements de test analytique et de personnel formé en radiochimie. Quelques traceurs sont disponibles à un prix abordable auprès des radiopharmacies commerciales, qui répartissent les coûts de production sur de nombreux clients, mais des milliers d'autres traceurs restent largement indisponibles.

Le programme de technologie de plate-forme de synthèse chimique se concentre sur l'élimination de cet obstacle, en développant des systèmes pour simplifier, miniaturiser et réduire le coût de production de divers traceurs PET. En fin de compte, nous visons à développer un système de paillasse autonome et convivial qui peut synthétiser une variété de radiotraceurs à la demande. Les systèmes en cours de développement couvrent l'ensemble du processus de production de traceurs PET, y compris la distribution du radio-isotope, la synthèse, la purification et la formulation du traceur, et les tests analytiques du lot final. La plupart de ces systèmes intègrent des composants microfluidiques pour tirer parti des nombreux avantages scientifiques et pratiques du travail à petite échelle. Nous sommes également intéressés par le développement d'outils permettant aux radiochimistes de découvrir plus facilement et plus rapidement de nouveaux traceurs et d'optimiser leur synthèse.

Les projets récents et en cours comprennent : (i) un distributeur de radio-isotopes et de sondes, (ii) un nouveau paradigme basé sur les opérations de « ldquounités » pour développer des programmes de synthèse automatisés, (iii) un synthétiseur compatible haute pression à 3 réacteurs (ELIXYS) pour la synthèse de complexes et divers traceurs, (iv) un synthétiseur microfluidique sur puce, (v) un système microfluidique pour optimiser les conditions de réaction pour l'immunoPET, (vi) un concentrateur de sondes PET microfluidique et (vii) un système d'imagerie Cerenkov pour surveiller les processus au sein des puces microfluidiques.


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Figure 1 : Concept envisagé de production de paillasse de traceurs PET pour éliminer les goulots d'étranglement et les coûts élevés des méthodes de production actuelles. Le synthétiseur de paillasse pourrait potentiellement être placé dans n'importe quel laboratoire de recherche en biologie ou centre d'imagerie clinique. L'utilisateur installerait un kit microfluidique conçu pour le traceur souhaité. L'ordinateur distribuerait automatiquement la quantité désirée de radio-isotope, la livrerait au radiosynthétiseur et synthétiserait le traceur sur puce. À partir d'un seul approvisionnement en radio-isotope, l'utilisateur peut réaliser des lots séquentiels de plusieurs traceurs différents à la demande, en fonction des besoins de la clinique ou du laboratoire de recherche.


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Figure 2 : Radiosynthétiseur ELIXYS pour la synthèse automatisée de divers traceurs TEP. Ce synthétiseur a été développé à l'UCLA puis commercialisé par Sofie Biosciences, Inc. Le schéma de droite montre les principaux éléments du synthétiseur : trois récipients de réaction, jusqu'à trois cassettes de réactifs jetables, un robot de manipulation de réactifs et une interface avec un Système de purification HPLC. En raison du principe de conception unique, ce système peut prendre en charge des réactions entièrement scellées à des pressions et des températures beaucoup plus élevées que les autres systèmes. De plus, l'utilisation de la robotique plutôt que des vannes élimine le besoin de reconfiguration/refonte du système, permettant ainsi la synthèse de divers traceurs sur un seul système. En plus du système lui-même, notre groupe a développé une nouvelle approche d'« opération ldquounit » pour programmer de nouveaux protocoles de synthèse. Cette approche réduit considérablement la complexité des programmes et réduit le temps de programmation.


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Figure 3 : Radiosynthétiseur microfluidique numérique. Grâce à la technologie d'électromouillage sur diélectrique (EWOD), les gouttelettes de réactifs peuvent être manipulées électroniquement pour effectuer les opérations de base (chargement des gouttelettes, déplacement, fusion, mélange, chauffage) nécessaires à la synthèse chimique à micro-échelle. Cette figure illustre la synthèse du traceur TEP le plus couramment utilisé, le [18F]FDG. En plus de la petite taille physique, qui réduit considérablement la quantité de protection contre les rayonnements nécessaire, il existe des avantages fondamentaux de la radiochimie dans des volumes minuscules.

Biologie des systèmes

La biologie des systèmes est fondamentale pour les objectifs du Crump Institute de développer de nouvelles in vitro et in vivo (imagerie) technologies de diagnostic moléculaire. En étudiant les cellules et les organismes d'un point de vue systémique, nous apprenons quels sont les événements les plus informatifs à détecter et à imager pour évaluer l'état sain ou malade des tissus du patient. Le programme de biologie des systèmes utilise une approche expérimentale et théorique intégrée pour étudier le cancer et les maladies immunitaires, et pour comprendre les interactions des micro-organismes avec l'hôte humain. Les microbes forment un système symbiotique complexe avec l'hôte. En étudiant les génomes et les transcriptomes des microbes vivant à l'intérieur des humains, nous visons à comprendre comment les micro-organismes interagissent avec et influencent le système immunitaire humain et jouent un rôle dans la santé et les maladies humaines. Les systèmes modèles, tels que les cellules normales et cancéreuses en culture, et les petits modèles animaux de la maladie, fournissent des environnements contrôlés où la composition génétique et les conditions environnantes peuvent être définies et analysées de manière systématique. Tout aussi importante est la capacité d'obtenir du sérum et des tissus de patients, qui reflètent directement la biologie de la maladie humaine. À partir de ces échantillons biologiques, des mesures à grande échelle à l'échelle du système peuvent être effectuées, de l'expression des gènes et des protéines qui produisent des systèmes de communication cellulaire et une activité métabolique pour exécuter les fonctions normales de nos systèmes organiques et celles modifiées de la maladie. Enfin, des approches théoriques et informatiques sont utilisées pour démêler le réseau complexe d'interactions et de boucles de rétroaction au sein des cellules et des tissus. Notre objectif fondamental est de déchiffrer les circuits intégrés à l'intérieur et entre les cellules - les réseaux qui forment la logique informatique, ou "la réflexion" de la cellule qui détermine comment elle réagira dans des conditions normales, ou réagira mal en cas de maladie.

Le programme de biologie des systèmes travaille en collaboration avec des médecins et des biologistes qui étudient des maladies comme le cancer et les troubles immunitaires pour aider à définir quels événements moléculaires doivent être détectés ou imagés en fonction de la biologie des cellules et des tissus affectés, et avec les programmes technologiques du Crump pour développer de nouvelles méthodes pour effectuer des mesures expérimentales et diagnostiques.

In vitroDiagnostic moléculaire (IVMD)

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Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules cancéreuses qui se détachent d'une tumeur primaire ou d'un site métastatique et circulent dans le sang périphérique en tant qu'origine cellulaire des métastases. Avec leur rôle de &ldquotumor biopsie liquide&rdquo, les CTC offrent un accès pratique à tous les sites de la maladie, y compris celui de la tumeur primaire et le site des métastases fatales. Il est concevable que la détection et l'analyse des CTC fourniront des informations utiles pour évaluer l'état de la maladie sans les défauts et les limitations rencontrés lors de la réalisation de biopsies tumorales conventionnelles. Cependant, l'identification des CTC dans les échantillons de sang des patients est techniquement difficile en raison de l'abondance extrêmement faible des CTC parmi un grand nombre de cellules hématologiques. Pour répondre à ce besoin non satisfait, d'importants efforts de recherche ont été consacrés au développement de technologies de détection, d'isolement et de caractérisation des CTC.

Inspirée par les interactions à l'échelle nanométrique observées dans le microenvironnement tissulaire, notre équipe de recherche à l'UCLA a lancé un concept unique de substrats d'affinité cellulaire &ldquoNanoVelcro&rdquo, dans lesquels des substrats nanostructurés revêtus d'agent de capture CTC ont été utilisés pour immobiliser les CTC avec une grande efficacité. Le mécanisme de fonctionnement des substrats d'affinité cellulaire NanoVelcro imite celui du Velcro TM &ndash lorsque les deux bandes de tissu d'une fermeture Velcro sont pressées l'une contre l'autre, l'enchevêtrement entre les surfaces poilues sur deux bandes entraîne une forte liaison. Grâce à une évolution continue, 3 générations (gens) de puces NanoVelcro CTC ont été établies pour atteindre différentes utilités cliniques. La puce NanoVelcro de 1re génération, composée d'un substrat de nanofil de silicium (SiNS) et d'un mélangeur chaotique microfluidique superposé, a été créée pour le dénombrement CTC. Des études de validation analytiques côte à côte utilisant des échantillons de sang cliniques ont suggéré que la sensibilité de la puce NanoVelcro de 1re génération surpasse celle de CellSearch TM approuvé par la FDA. En conjonction avec l'utilisation de la technique de microdissection laser (LMD), des puces NanoVelcro de 2e génération (c. Les CTC isolés individuellement peuvent être soumis à un génotypage à CTC unique (par exemple, séquençage de Sanger et séquençage de nouvelle génération, NGS) pour vérifier le rôle de CTC en tant que biopsie liquide tumorale. En greffant des brosses polymères thermosensibles sur des SiNS, des puces NanoVelcro de 3e génération (c'est-à-dire des nanoVelcro thermosensibles) ont démontré la capture et la libération de CTC à 37 et 4°C, respectivement. Les changements de conformation dépendant de la température des brosses en polymère peuvent altérer efficacement l'accessibilité de l'agent de capture sur le SiNS, permettant une purification rapide du CTC avec la viabilité et l'intégrité moléculaire souhaitées. Nous prévoyons que les dosages NanoVelcro CTC ouvriront la voie à des plates-formes de diagnostic puissantes et rentables permettant aux chercheurs de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la maladie et aux médecins de surveiller la progression de la maladie en temps réel.

Imagerie moléculaire utilisant ImmunoPET

Dans le cadre de l'objectif général du Crump Institute de fournir des stratégies d'imagerie de plate-forme pour la détection de tout biomarqueur moléculaire de choix, nous développons des anticorps modifiés comme moyen d'imagerie des protéines de surface cellulaire in vivo. Environ 20 % des protéines d'une cellule sont exprimées à sa surface, ce qui les rend accessibles aux sondes d'imagerie moléculaire à base d'anticorps. Ces biomarqueurs de la surface cellulaire comprennent des classes importantes de protéines telles que les récepteurs de facteurs de croissance, les molécules d'adhésion, les enzymes et les protéases, les marqueurs spécifiques aux tissus, les marqueurs de différenciation et d'activation, ce qui rend la surface cellulaire très riche en cibles informatives pouvant révéler l'état biologique de la cellule , à la fois dans les états normaux et dans leurs transitions vers la maladie.

Des anticorps de haute spécificité pour une cible protéique sélectionnée peuvent être facilement isolés par des méthodes telles que la présentation sur phage. Le groupe ImmunoPET conçoit ensuite génétiquement ces anticorps pour une fonction optimale en tant qu'agents d'imagerie - ciblage rapide et de haut niveau vers une protéine spécifique et faible bruit de fond non spécifique dans les tissus environnants. L'équipe ImmunoPET s'appuie sur des collaborations avec les programmes de biologie des systèmes et de diagnostic moléculaire pour identifier les protéines de surface cellulaire informatives en tant que biomarqueurs dans la maladie, en particulier dans le cancer et les troubles immunitaires. La mise en œuvre de ces stratégies nécessite une étroite collaboration avec les programmes de synthèse chimique et d'imagerie préclinique pour radiomarquer et évaluer rapidement ces nouveaux traceurs dans des modèles animaux de maladies.


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Figure 1 : Fragments d'anticorps conçus pour l'imagerie TEP in vivo de marqueurs de surface cellulaire. Le panneau supérieur montre un anticorps natif et intact avec les régions variables qui forment le site de liaison indiqué en vert et les domaines constants en bleu. Les fragments d'ingénierie représentés comprennent des fragments variables à chaîne unique (scFv), le diabody (un dimère de fragments scFv) et le minibody (fusion de scFv et CH3 domaine). Le panneau inférieur montre des tranches coronales d'images microPET/microCT co-enregistrées avec des flèches indiquant la tumeur, toutes acquises à 20 h après l'administration intraveineuse d'un fragment d'anticorps modifié radiomarqué chez des souris athymiques portant différentes xénogreffes de tumeurs humaines sous-cutanées. A. Imagerie d'une tumeur du cancer du colon LS174T à l'aide d'un diabody spécifique à l'antigène carcinoembryonnaire (CEA) marqué avec l'émetteur de positons 124 IB Imagerie d'un lymphome à cellules B à l'aide d'un minibody spécifique à CD20 marqué avec 124 IC Détection d'un cancer de la prostate LAPC-9 xénogreffe à l'aide d'un minicorps qui reconnaît l'antigène des cellules souches de la prostate (PSCA), marqué au 124 I.


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Figure 2 : Imagerie immuno-PET de 64 Cu-NOTA-2,43 Mb 4 h p.i. est montré. Les images immuno-PET/CT ont été acquises 4 h après i.v. injection chez des souris B/6. Les flèches blanches (PIM transversales de 2 mm) sont utilisées pour mettre en évidence la fixation dans divers ganglions lymphatiques (à droite) et la rate observée dans les PIM coronales de 20 mm du corps entier (à gauche). A.LN, ganglions lymphatiques axillaires B, os C.LN, ganglions lymphatiques cervicaux I.LN, ganglions lymphatiques inguinaux Li, MIP hépatiques, projections d'intensité maximale P.LN, ganglions lymphatiques poplités Sp, Rate. Proc Natl Acad Sci USA. 21 janvier 2014 111(3) : 1108&ndash1113.

Systèmes d'imagerie préclinique

L'imagerie préclinique à l'Institut Crump couvre des domaines allant du diagnostic in vitro et des cultures cellulaires d'imagerie à l'imagerie in vivo de modèles murins de maladie, en utilisant des modalités de microPET, de microCT et d'imagerie optique. Dans l'ensemble, l'objectif du programme Systèmes d'imagerie préclinique est de développer des technologies innovantes qui permettent la visualisation et la mesure des processus biologiques afin de faciliter la recherche sur les mécanismes moléculaires des cellules en bonne santé et malades. Pour atteindre ces objectifs, des capteurs d'imagerie à l'état solide à base de silicium hautement sensibles (Position Sensitive Avalanche Photodiode Detectors, ou PSAPD) sont en cours de développement et peuvent détecter des sondes radiomarquées à des quantités aussi faibles que quelques picocuries. Ces dispositifs sont intégrés à des puces microfluidiques en collaboration avec les domaines de programme de la plate-forme de diagnostic moléculaire in vitro et de synthèse chimique pour produire de nouveaux dispositifs d'imagerie pour les tests in vitro dans des matrices de cultures cellulaires dans des puces. Pour l'imagerie in vivo, une instrumentation multimodale est conçue et optimisée pour combiner la TEP avec l'imagerie anatomique (telle que la tomodensitométrie) et l'imagerie optique de modèles murins de maladie. Ces technologies de pointe sont mises à la disposition des enquêteurs de Crump en coordination avec le Centre de technologie d'imagerie préclinique.


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(a) Coupe transversale d'une puce microfluidique couplée à une caméra à détecteur de photodiode à avalanche sensible à la position (PSAPD) à base de silicium (b) Linéarité et plage dynamique de la caméra PSAPD jusqu'à la détection minimale de l'activité (MDA) (c) Cultures cellulaires incubées avec [F-18] 2-fluorodésoxyglucose (FDG) pendant 30 minutes. Les puits de culture cellulaire dans la puce microfluidique intégrée ont un nombre progressivement décroissant de cellules dans des puits individuels. Les deux puits de la rangée la plus basse n'ont qu'une seule cellule (flèches) (d) L'analyse quantitative indique que l'activité FDG moyenne retenue dans chaque cellule est la même pour tous les puits.

Diagnostic moléculaire dans le cancer et les troubles immunitaires

Le cancer et l'immunologie sont étroitement liés à plusieurs niveaux. Par exemple, les cellules cancéreuses ainsi que les cellules immunitaires (lymphocytes B et T, macrophages et autres cellules qui participent de manière coordonnée aux réponses immunitaires), subissent toutes deux des programmes similaires d'activation, d'expression génique modifiée, de prolifération et de migration accrues. L'élucidation des signatures moléculaires associées à la transition d'un tissu normal à une lésion cancéreuse et à l'activation du système immunitaire pour lutter contre les agents pathogènes et les tumeurs pourrait conduire à l'identification de nouveaux biomarqueurs capables de distinguer avec précision les états de santé et de maladie aux niveaux moléculaire et cellulaire . De plus, s'il est largement admis qu'une fonction immunitaire anormale est la marque de nombreuses maladies, notamment le cancer, les troubles auto-immuns, les maladies cardiovasculaires, le diabète et les troubles neurologiques, le système immunitaire est de plus en plus reconnu comme un organe sensoriel interne capable de -surveillance temporelle des cellules et des tissus dans tout le corps. Les écarts par rapport à la physiologie normale dus à une infection, à l'activation d'oncogènes et à d'autres types de lésions cellulaires peuvent être détectés par le système immunitaire, entraînant des réponses cellulaires et humorales programmées. À leur tour, ces réponses entraînent des changements dynamiques dans la composition des compartiments essentiels du système immunitaire, y compris le répertoire des cellules T.

Le programme Molecular Diagnostics a développé de nouvelles technologies pour l'analyse à haut débit du répertoire des cellules T dans des modèles animaux et chez l'homme. La sensibilité accrue et la capacité de multiplexage de cette approche amélioreront considérablement notre capacité à surveiller les réponses immunitaires à l'aide de nouvelles plateformes de diagnostic in vitro. En outre, une nouvelle plate-forme de découverte de sondes PET basée sur le criblage différentiel pour sélectionner des sondes moléculaires qui ciblent des protéines spécifiques d'un processus biologique ou d'une maladie a déjà conduit au développement d'une série de sondes d'imagerie pour surveiller l'activation immunitaire et peut être utilisée pour prédire les réponses du cancer. aux médicaments de chimiothérapie courants. Ces traceurs ont été largement évalués dans des modèles précliniques et ont été introduits en clinique pour des études chez des patients en moins de 18 mois.

Traceur et modélisation pharmacocinétique

L'objectif ultime du Crump Institute for Molecular Imaging est de développer des technologies et des méthodes de mesure des fonctions biologiques chez des sujets vivants. Ces efforts permettent la quantification d'événements moléculaires précis dans les cellules avec des informations spatiales concernant leur emplacement dans des tissus et des systèmes organiques spécifiques et des informations temporelles (changements dans le temps) pour déterminer les taux de processus biologiques et de réactions biochimiques. Afin de faciliter l'interprétation des résultats, la reconstruction, l'archivage et l'affichage convivial des images sont essentiels.

Nos objectifs, cependant, vont au-delà de la visualisation de données expérimentales pour convertir des images en tests de processus biologiques grâce à la capacité de mesure quantitative de la TEP. Le cadre expérimental dans ce domaine de programme va du développement d'essais dans des conditions contrôlées in vitro de mesure cinétique avec des sondes radiomarquées dans des matrices de cultures cellulaires sur une puce microfluidique intégrée à un sujet vivant.Le programme Tracer and Pharmacokinetic Modeling centralise l'analyse et l'interprétation des mesures cinétiques in vitro sur puce et des mesures in vivo avec microPET, en effectuant une correction de volume partielle pour surmonter la résolution spatiale finie des images TEP, en développant des modèles cinétiques pour de nouveaux traceurs, et simplifier et automatiser les procédures pour les rendre accessibles et transparentes aux enquêteurs aux formations variées et non mathématiques. Si nécessaire, de nouvelles technologies et méthodes sont développées et introduites, telles qu'une méthode PVC sans la disponibilité d'informations anatomiques. En conséquence, des mesures précises peuvent être faites de la biochimie, du métabolisme et de la signalisation dans les cellules et les tissus, chez un sujet vivant. Il est important de noter que ces mesures peuvent être effectuées au fil du temps, par exemple au cours du développement de la maladie, ou avant et après l'administration d'un traitement ciblé, afin de mesurer plus précisément la biologie de la maladie et d'évaluer l'efficacité de diverses interventions thérapeutiques.


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Figure 1 : Esquisse des multiples étapes contenues dans un système logiciel en cours de développement pour automatiser l'analyse des données d'image microPET de souris après l'acquisition d'images. Une fois terminé, le système devrait remplacer les procédures d'analyse d'images manuelles actuelles qui prennent du temps, sont fastidieuses et demandent beaucoup de travail. De plus, les informations cinétiques et biologiques extraites seront archivées et liées à un système de méta-base de données qui contient un moteur de recherche rapide pour permettre aux enquêteurs d'effectuer facilement une recherche et une extraction de données. L'analyse cinétique utilise un progiciel déjà développé, Kinetic Imaging System (KIS), développé par notre groupe.


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Figure 2 : Résultats de simulation d'une nouvelle méthode PVC qui ne nécessite pas la connaissance des informations anatomiques de l'objet. La méthode devrait être utile pour améliorer la quantification de l'absorption tumorale des traceurs dans les images TEP. Dans une étude de simulation (avec la vraie distribution montrée dans le panneau supérieur gauche), la performance de la nouvelle méthode dans le traitement d'une image mesurée simulée (panneau supérieur droit) a donné une délimitation nette de la tumeur et avec seulement une amélioration modérée du bruit (montré en bas à gauche panel), comparé à celui d'une méthode de déconvolution générale (résultat affiché en bas à droite).


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Figure 3 : Une étude tumorale chez une souris utilisant les images séquentielles avec microPET des sondes marquées F-18 FLT pour l'imagerie de la réplication de l'ADN et de la prolifération cellulaire qui a été injectée en premier, puis 60 minutes plus tard, du FDG a été injecté en IV pour imager la glycolyse. En plus de l'imagerie continue, des échantillons de sang ont été obtenus par un échantillonneur de sang microfluidique : (A) images - tumeur représentée par des flèches (B) courbes sanguines (C) courbes de tissu tumoral et (D) données cinétiques pour le FLT et le FDG dans la tumeur après séparation des courbes cinétiques individuelles à partir des courbes composites en B et C. Ces données ont ensuite été utilisées pour calculer les constantes de vitesse pour le transport (k1 et k2) et la phosphorylation (k3) et la déphosphorylation (k4).


RÉSULTATS

PI3K est essentiel pour les saillies et l'adhésion cellulaires induites par GbpD/Rap1

Auparavant, le phénotype fort GbpD OE était utilisé pour dépister les cibles en aval de GbpD et Rap1 dans Dictyostelium (Kortholt et al., 2006). La GbpD était surexprimée chez les mutants présentant un défaut d'adhésion ou de polarité cellulaire, et Phg2, une kinase spécifique à la sérine/thréonine, a été identifiée comme un effecteur Rap1 nécessaire à l'adhésion mais pas à la polarité cellulaire et à la chimiotaxie (Kortholt et al., 2006).

PIP3 est connu pour être un puissant inducteur de la formation de pseudopodes (Parent et al., 1998 Funamoto et al., 2002 Huang et al., 2003). Pour étudier le rôle possible de PIP3 dans l'extension accrue des pseudopodes par les cellules GbpD OE, nous avons surexprimé GbpD dans les cellules dépourvues de PI3K1/PI3K2 (pi3k1/2- nul). La perturbation de PI3K1/PI3K2, entraîne des cellules qui ont une quantité fortement réduite de PIP3, une activation AKT/PKB réduite de 90 % en réponse à l'AMPc, des défauts de polarité et une vitesse de chimiotaxie réduite (Zhou et al., 1998 Funamoto et al., 2001, 2002). Tout d'abord, la morphologie des mutants a été analysée au microscope. Les cellules de type sauvage surexprimant la GbpD (AX3/GbpD OE) étendaient davantage de pseudopodes et étaient très grandes et plates par rapport aux cellules de type sauvage (AX3 Figure 1A.). La microscopie confocale à fluorescence a révélé que la GbpD marquée par la GFP était exprimée dans pi3k1/2- cellules nulles à des niveaux approximativement égaux à ceux des cellules de type sauvage (données non présentées). Bien qu'exprimant des quantités similaires de GbpD, pi3k1/2- cellules nulles surexprimant GbpD (pi3k1/2 − /GbpD OE) n'a pas montré une quantité accrue de pseudopodes ou une morphologie cellulaire aplatie (Figure 1, A et B). De plus, affamé pi3k1/2-null et pi3k1/2Les cellules OE -null/GbpD, bien que défectueuses dans la polarité cellulaire, sont capables de s'agréger et ont montré un développement normal, tandis que les cellules OE AX3/GbpD étaient incapables de s'agréger (figure 1C).

Figure 1. Morphologie cellulaire et adhésion des cellules pi3k1/2-null surexprimant GbpD. Pour étudier le rôle de PI3K dans la voie de la GbpD, la GbpD a été exprimée dans le type sauvage (AX3) et pi3k1/2-cellules nulles et également dans les cellules surexprimant l'enzyme dégradant PIP3 PTEN. (A) Images en contraste de phase de type sauvage, pi3k1/2-null et cellules exprimant PTEN-GFP, cultivées dans du milieu HG-5. Barre d'échelle, 10 m. (B) Quantification de la zone de contact (gris) et du nombre de protubérances (noir) dans AX3, pi3k-les cellules nulles et AX3/PTEN-GFP sans (contrôle) ou avec surexpression de GbpD ont été réalisées comme décrit (Bosgraaf et al., 2005). Les données sont présentées en pourcentage de cellules GbpD OE par rapport à ses valeurs de contrôle sont des barres d'erreur moyennes, SD n = 10 cellules. (C) Agrégation de cellules de type sauvage (AX3) et mutantes sur gélose après 24 h de famine. (D et E) L'attachement cellulaire a été déterminé en mesurant le pourcentage de cellules végétatives de type sauvage et mutantes non adhérentes après 1 h de rotation. Les résultats sont les barres d'erreur moyennes, SD n = 3 expériences indépendantes. L'effet de GbpD OE est significatif **p < 0,001 *p < 0,05 NS, non significatif.

Deuxièmement, les capacités adhésives des lignées cellulaires ont été testées via un test d'adhésion. Comme le montre la figure 1D, 77 % des pi3k1/2-les cellules nulles se sont détachées du substrat après 1 h d'agitation, un pourcentage légèrement supérieur à celui des cellules de type sauvage (68%). Les cellules AX3/GbpD OE ont montré une forte augmentation de l'adhésion cellule-substrat, car seulement 18% des cellules se sont détachées après 1 h d'agitation. En revanche, l'attachement cellulaire dans pi3k1/2 − /GbpD cellules OE est similaire à celle pour pi3k1/2-cellules nulles (76% détachées). Ces résultats suggèrent que PI3K est essentiel pour l'adhésion induite par la GbpD. Pour étudier le rôle de Rap1 de manière plus directe, nous avons exprimé des mutants constitutifs actifs (Rap1G12V) et dominants négatifs (Rap1S17N) dans des cellules de type sauvage et pi3k1/2-cellules nulles. L'attachement cellulaire est considérablement amélioré dans les cellules AX3/Rap1G12V et est réduit dans les cellules AX3/Rap1S17N comme décrit précédemment (Figure 1E Jeon et al., 2007b). Conformément au rôle essentiel de PI3K dans l'adhésion médiée par GbpD/Rap1, l'expression de Rap1G12V ou Rap1S17N n'altère pas l'attachement cellule-substrat de pi3k1/2-cellules nulles.

Troisièmement, nous avons analysé les propriétés de chimiotaxie des mutants. Lorsqu'une pipette remplie d'AMPc est placée dans l'environnement de cellules de type sauvage affamées, les cellules répondent rapidement et chimiotaxent de manière persistante vers la source d'AMPc, comme le montre la figure 2. pi3k1/2-les cellules nulles présentent une bonne chimiotaxie vers la pipette (Funamoto et al., 2002). La surexpression de GbpD dans les cellules de type sauvage inhibe fortement la chimiotaxie car ces cellules ont montré peu de mouvement vers la pipette. En revanche pi3k1/2 − /GbpD Les cellules OE présentent une réponse de chimiotaxie presque identique à la réponse du parent pi3k1/2 − lignée cellulaire (Figure 2).

Figure 2. Dosage de la chimiotaxie. Pour analyser le comportement de chimiotaxie de type sauvage (AX3), pi3k1/2 − , AX3/GbpD OE et pi3k − /GbpD OE souches, les cellules ont été affamées et puisées pendant 6 à 8 h, remises en suspension dans du PB et contrôlées par microscopie à contraste de phase. Les cellules ont été stimulées avec une micropipette contenant 10 -4 M d'AMPc, en partant de la droite. Les contours des cellules sont affichés à intervalle de 1 min pour AX3, pi3k1/2 − , et pi3k1/2 − /GbpD OE et à intervalles de 5 min pour AX3/GbpD OE pour un total de 15 min.

La surexpression de GbpD dans le type sauvage affecte la morphologie cellulaire, l'adhésion et la chimiotaxie. Les résultats présentés ici montrent qu'aucun de ces effets n'est observé lors de la surexpression de GbpD dans pi3k1/2-cellules nulles ou addition de l'inhibiteur de PI3K LY294002 (données non présentées), indiquant que PI3K est essentiel pour toutes ces voies de signalisation médiées par la GbpD.

Niveaux PIP3 améliorés dans les cellules GbpD OE

Pour déterminer si GbpD est capable de réguler PI3K in vivo, l'effet de la surexpression de GbpD sur les niveaux de PIP3 a été mesuré en exprimant le détecteur PIP3 PHcracGFP dans des cellules GbpD OE (Parent et al., 1998). Les cellules exprimant AX3/PHcracGFP non stimulées et différenciées se sont déplacées dans des directions aléatoires et ont montré une localisation de PHcrac uniformément répartie dans le cytosol (Figure 3A, Film 1). Au contraire, les cellules GbpD OE/PHcracGFP non stimulées ont produit des patchs PIP3 multiples et larges le long de toute la membrane plasmique, à partir desquels plusieurs pseudopodes sont étendus (Figure 3A, Film 2).

Figure 3. Effet de l'expression de GbpD sur l'activité PI3K. (A) Pour étudier l'effet de GbpD OE sur les niveaux de PIP3, le détecteur PIP3 PHcracGFP a été exprimé dans des cellules de type sauvage, GbpD OE, RapG12V OE et RapS17N OE. Des images confocales sont présentées pour les cellules non stimulées (à gauche) et pour les cellules stimulées par l'AMPc à partir d'une micropipette à droite (à droite). Les films 1 et 2 pour les cellules de type sauvage et GbpD OE, respectivement, sont disponibles en tant qu'informations supplémentaires. (B) Phosphorylation de la PKB dans les cellules de type sauvage et GbpD OE. Les cellules ont été pulsées avec de l'AMPc puis stimulées avec 1 uM d'AMPc. Les échantillons ont été prélevés aux temps indiqués et lysés directement dans le tampon de chargement SDS. Les échantillons ont été soumis à SDS-PAGE et analysés par Western blot en sondant avec un anticorps spécifique de la phospho-thréonine. La protéine ∼51-kDa indiquée correspond à la phosphorylation de PKB/Akt. Le transfert représenté est représentatif de trois expériences indépendantes. (C) Quantification de la phosphorylation de la PKB pour les cellules AX3 (○) et GbpD OE (•). Les données sont présentées sous forme d'augmentation par rapport aux cellules AX3 avant stimulation.

Les cellules AX3/PHcracGFP et GbpD OE/PHcracGFP ont été stimulées avec de l'AMPc. Semblable aux enquêtes précédentes (parent et al., 1998 Funamoto et al., 2002 Huang et al., 2003), l'introduction d'une pipette remplie d'AMPc dans l'environnement de cellules de type sauvage a induit une forte translocation de PHcracGFP du cytosol vers le bord d'attaque (Figure 3A, Film 1). Les pseudopodes s'étendent à partir des zones de la membrane plasmique contenant du PHcracGFP et les cellules se déplacent de manière persistante vers la pipette. Au contraire, les cellules GbpD OE /PHcracGFP fabriquent des patchs PIP3 multiples et larges le long de toute la membrane plasmique. Les cellules s'étendent de multiples pseudopodes fonctionnels à l'avant et sur les côtés et ont montré peu de mouvement vers la pipette (Figure 3A, Film 2). Chez Dictyostelium, l'activité d'Akt/PKB est transitoirement stimulée en réponse à l'AMPc, d'une manière dépendante de PIP3 (Meili et al., 1999 Lim et al., 2005). Akt/PKB est activé par phosphorylation à un résidu thréonine conservé, qui peut être détecté en utilisant un anticorps spécifique de la phospho-thréonine (Lim et al., 2005 Kortolt et al., 2007). Les cellules de type sauvage et GbpD OE ont été stimulées avec cAM, et les lysats cellulaires ont été analysés par Western blot. Dans les lysats de cellules de type sauvage, une protéine de 51 kDa a été phosphorylée de manière transitoire, atteignant un pic à 10 s après la stimulation (Figure 3, B et C). Les cellules GbpDOE présentent un niveau basal environ deux fois plus élevé de PKB active, la réponse à l'AMPc est similaire à celle du type sauvage, mais elle récupère à l'activité basale élevée.

Ces expériences montrent que les cellules GbpD OE ont une formation améliorée de PIP3. De manière cohérente, les cellules exprimant RapG12V actif dominant fabriquent également de larges patchs PIP3 et présentent une chimiotaxie médiocre (figure 3A). Ces données suggèrent un rôle stimulateur pour GbpD et Rap1 dans la régulation de l'activité PI3K.

La distribution subcellulaire de Rap1 activé coïncide avec l'activation de PI3K et la formation de PIP3

Pour examiner la localisation de l'activation de Rap1, une construction RalGDS-RBD fusionnée à la GFP (GFP-RBDRalGDS) a été exprimé dans les cellules AX3 et AX3/GbpD OE. Auparavant, il a été démontré que GFP-RBDRalGDS n'interagit qu'avec la forme de Rap liée au GTP et peut être utilisé comme rapporteur pour étudier les changements dynamiques de l'activation de Rap dans les cellules humaines (Bivona et al., 2004). Comme PHcracGFP, GFP-RBDRalGDS est principalement localisé dans le cytosol des cellules de type sauvage non stimulées (Figure 4A, Film 3), alors que dans les cellules GbpD OE, des plaques multiples et larges de GFP-RBDRalGDS le long de la membrane plasmique entière ont été observés (figure 4B). Étant donné que la GbpD n'active pas RasC ou RasG, ces résultats indiquent que la GFP-RBDRalGDS La sonde peut être utilisée pour visualiser l'activation de Rap, bien qu'elle puisse ne pas être complètement spécifique. Comme le montre le panneau de droite de la figure 4A, l'introduction d'une pipette remplie d'AMPc dans l'environnement des cellules de type sauvage a entraîné la translocation rapide de la GFP-RBD cytosoliqueRalGDS à la membrane, similaire à la translocation du détecteur PIP3 PHcracGFP (Parent et al., 1998 Funamoto et al., 2002 Huang et al., 2003). Jeon et al. (2007) ont précédemment présenté une localisation similaire de Rap activé dans des cellules de type sauvage à celle présentée ici. Au contraire, les cellules GbpD OE fabriquent de multiples et larges GFP-RBDRalGDS patchs le long de toute la membrane plasmique (figure 4B), similaire à la distribution de PHcracGFP. Ces données montrent que la localisation de l'activation de Rap1 coïncide avec la localisation de l'activation de PI3K et la formation de PIP3.

Figure 4. Localisation subcellulaire de l'activation de Rap1. Pour analyser la localisation subcellulaire de l'activation de Rap1, le GFP-RBDRalGDS rapporteur a été exprimé en AX3 (A) et AX3/GbpD OE (B). Des images confocales sont présentées pour les cellules non stimulées (à gauche) et pour les cellules stimulées par l'AMPc à partir d'une micropipette à droite (à droite).

Rap1 et RasG se lient au domaine RBD de PI3K

PI3K se compose d'une région de ciblage membranaire N-terminale, d'un RBD, d'un domaine de liaison aux lipides C2, d'un domaine d'association catalytique PI3K (PI3Ka) et d'un domaine catalytique PI3K (PI3Kc Figure 5A). Les domaines RBD ont un repliement d'ubiquitine et interagissent étroitement uniquement avec la conformation liée au GTP mais pas avec la conformation liée au GDP des protéines de type Ras (Herrmann, 2003). Des études antérieures ont montré que le RBD de PI3K est essentiel pour son activation et il a été démontré qu'il interagit faiblement avec RasD et RasC et fortement avec RasG (Funamoto et al., 2002 Kae et al., 2004). Pour étudier plus avant la spécificité de liaison, des expériences de pulldown avec le domaine RBD de PI3K1-3 ont été réalisées. Comme le montre la figure 5B, les trois domaines PI3K RBD sont capables de se lier à Rap1 et RasG activés avec des propriétés similaires. Jeon et al. (2007b) ont montré que Rap1 est rapidement activé lors de la stimulation de l'AMPc. Conformément à ces résultats, Rap1 plus actif a été détecté dans les lysats cellulaires stimulés avec l'AMPc que dans les lysats provenant de cellules non stimulées (figure 5B). Pour caractériser davantage l'interaction PI3K/Rap1 et PI3K/RasG, des tests GDI in vitro ont été effectués. L'interaction de la protéine G liée au GTP avec une protéine effectrice stabilise l'interaction entre la protéine G et le nucléotide. Cette stabilisation entraîne une diminution de la dissociation du nucléotide du complexe G-protéine/nucléotide/effecteur (Herrmann et al., 1996). L'incubation de la protéine G chargée de mGppNHp, un analogue fluorescent du GTP résistant à l'hydrolyse, avec un excès de GppNHp non marqué entraîne l'échange de mGppNHp contre GppNHp. Cet échange est suivi comme la décroissance de la fluorescence, à partir de laquelle la constante de vitesse kobs est calculé. L'ajout de concentrations croissantes de l'effecteur entraîne une diminution dépendante de la concentration de kobs. L'affinité (K) entre la protéine G et l'effecteur est déterminé à partir de cette dépendance (Herrmann et al., 1996). Pour l'interaction PI3K/Rap1 et PI3K/RasG nous avons déterminé une K de 40 et 24 M, respectivement (Figure 5, C et D). Cette affinité est similaire à celle décrite pour l'interaction entre Rap1 et Phg2 (Kortholt et al., 2006) et l'interaction du Rap humain avec plusieurs effecteurs (Wohlgemuth et al., 2005). Ensemble, nos données montrent que Rap1 et RasG in vivo et vitro se lient avec approximativement la même affinité et la même spécificité à PI3K.

Figure 5. Interaction entre le domaine RBD de PI3K et Rap1. (A) Schéma montrant la composition du domaine de PI3K. Le crochet indique le fragment isolé. RBD, domaine de liaison Ras PI3Ka, domaine d'association catalytique PI3K PI3Kc, domaine catalytique PI3K. (B) Pour déterminer la capacité de Rap1 et RasG à se lier aux domaines RBD de PI3K1, PI3K2 et PI3K3, des expériences de pulldown ont été réalisées. Aux moments indiqués après la ou les stimulations de l'AMPc, les quantités de Rap1 activé (en haut) et de RasG (en bas) qui se sont liés aux constructions GST-RBD indiquées ont été déterminées, comme décrit dans Matériaux et méthodes. Dans la piste 1, la quantité totale de protéine G dans le lysat est indiquée (L). Le domaine RBD précédemment décrit de Schizosaccharomyces pombe Byr2 a été utilisé comme contrôle de l'activité des protéines G (pistes 2-4). Le taux de dissociation de mGpp(NH)p de Rap1 (C) et RasG (D) a été mesuré en présence de concentrations variables de PI3K2-RBD. Ces données ont été utilisées pour calculer les constantes de vitesse observées, kobs. Le Kobs les valeurs ont été tracées en fonction de la concentration effectrice indiquée de PI3K-RBD. L'ajout de concentrations croissantes de l'effecteur entraîne une diminution dépendante de la concentration de kobs. Ces données ont été utilisées pour calculer la constante de dissociation du complexe Rap1-GTP/PI3K-RBD et RasG-GTP/PI3K-RBD, donnant un K de 40 et 24 M, respectivement.

Le phénotype GbpD OE est perdu lors de la surexpression de l'enzyme dégradant PIP3 PTEN

Les données présentées dans les sections précédentes suggèrent que la formation de PIP3 régulée par GbpD/Rap est importante pour la morphologie cellulaire, l'adhésion et la chimiotaxie. Si la formation de PIP3 est essentielle pour la signalisation médiée par GbpD, l'expression de l'enzyme de dégradation PIP3 PTEN devrait interférer avec les processus médiés par GbpD. Pour étudier cette hypothèse, PTEN a été exprimé dans des cellules de type sauvage (AX3) et GbpD OE. L'expression de PTEN dans les cellules de type sauvage n'a pas influencé la morphologie cellulaire (figure 1A) ou la capacité adhésive (figure 1D). En revanche, le phénotype fort des cellules GbpD OE a été perdu lors de l'expression de PTEN.La surexpression de GbpD dans les cellules AX3 a induit une augmentation d'environ 125 % de la surface de contact et du nombre de protubérances (figure 1B). La surexpression de PTEN-GFP dans ces cellules (AX3/GbpD OE/PTEN-GFP) a entraîné une réduction prononcée de l'augmentation induite par la GbpD OE de la surface de contact et du nombre de saillies (figure 1B). En outre, la forte fixation au substrat des cellules GbpD OE (seulement 18 % des cellules détachées du substrat après 1 h d'agitation) est presque complètement perdue lors de l'expression de PTEN (64 % des cellules détachées Figure 4D). Enfin, bien que les cellules AX3/GbpD OE ne parviennent pas à s'agréger en cas de famine, la surexpression de PTEN dans ces cellules permet l'agrégation cellulaire (figure 1C). Ces données révèlent que l'enzyme dégradant PIP3 PTEN inverse largement tous les défauts phénotypiques induits par la surexpression de GbpD.


<p>Cette section fournit toutes les informations utiles sur la protéine, principalement des connaissances biologiques.<p><a href='/help/function_section' target='_top'>Plus. </a></p> Fonction i

Fonctionne comme un facteur d'échange de nucléotides de guanine (GEF), qui active la famille Rap et Ras de petites GTPases en échangeant le GDP lié contre le GTP libre d'une manière dépendante de l'AMPc. Sert de lien entre les récepteurs de surface cellulaire et les Rap/Ras GTPases dans les cascades de signalisation intracellulaire. Agit également comme effecteur pour Rap1 par association directe avec Rap1-GTP conduisant ainsi à l'amplification de la signalisation médiée par Rap1. Montre une faible activité sur HRAS. Il est controversé de savoir si RAPGEF2 se lie ou non à l'AMPc et au GMPc. Sa liaison au récepteur adrénergique bêta-1 activé par un ligand ADRB1 conduit à l'activation de Ras par la voie de signalisation G(s)-alpha. Impliqué dans la voie de signalisation Ras et Erk1/2 induite par l'AMPc qui conduit à une inhibition soutenue de la mélanogénèse à long terme en réduisant l'extension des dendrites et la synthèse de mélanine. Fournit également des signaux inhibiteurs pour la prolifération cellulaire des cellules de mélanome et favorise leur apoptose dans une nourrice indépendante de l'AMPc. Régule la neuritogenèse induite par l'AMPc en médiant la signalisation Rap1/B-Raf/ERK par une voie indépendante à la fois de la PKA et de RAPGEF3/RAPGEF4. Impliqué dans la migration des neurones et dans la formation des principales connexions des fibres du cerveau antérieur formant le corps calleux, la commissure antérieure et la commissure hippocampique au cours du développement du cerveau. Impliqué dans l'activation soutenue induite par le facteur de croissance neuronale (NGF) de Rap1 au niveau des endosomes tardifs et dans l'excroissance axonale induite par le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) des neurones de l'hippocampe. Joue un rôle dans la régulation de la formation des vaisseaux sanguins embryonnaires et dans l'établissement de l'intégrité de la jonction basale et de la fonction de barrière endothéliale. Peut être impliqué dans la régulation de l'expression du récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire KDR et de la cadhérine CDH5 aux jonctions cellules-cellules endothéliales allantoïdes.

<p>Informations organisées manuellement pour lesquelles il existe des preuves expérimentales publiées.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000269">Plus. </a></p> Assertion manuelle basée sur l'expérience dans i


Voir la vidéo: 5 HITS SANS LENDEMAIN DU RAP FR SPÉCIAL ANNÉES 2000 (Janvier 2022).