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9.6 : Conjugaison - Biologie


Il existe deux autres processus qui peuvent conduire au transfert horizontal de gènes chez les bactéries : la conjugaison et la transduction. Contrairement à la transformation, ces processus « forcent » l'ADN dans ce qui peut être une cellule réticente. Dans le processus de conjugaison, on peut distinguer deux types de cellules bactériennes (de la même espèce). L'un contient un plasmide connu sous le nom de plasmide du facteur sexuel (F). Celles-ci sont connues sous le nom de cellules Hfr (recombinaison haute fréquence). Ce plasmide contient les gènes nécessaires pour transférer une copie de son ADN dans une cellule dépourvue d'un plasmide F, ce qu'on appelle la cellule F. Parfois, le plasmide F peut s'intégrer (s'insérer) dans le chromosome de la cellule hôte et lorsque cela se produit, le système médié par le plasmide F peut transférer les gènes de la cellule hôte (en plus des gènes plasmidiques) dans une cellule F. Pour simplifier un peu les choses, nous appellerons la cellule Hfr le donneur d'ADN et les cellules F les receveurs d'ADN.

Pour initier la conjugaison, la cellule Hfr établit un pont physique avec la cellule F. Une rupture dans l'ADN du donneur initie un processus par lequel l'ADN simple brin est synthétisé et déplacé dans la cellule receveuse (F–). La quantité d'ADN transportée est déterminée en grande partie par la durée pendant laquelle le pont transporteur reste intact. Il faut environ 100 minutes pour transférer l'intégralité du chromosome du donneur d'une cellule Hfr à une cellule F. Une fois à l'intérieur de la cellule F, l'ADN est intégré dans le chromosome du receveur, remplaçant les versions du receveur des gènes transférés (par un processus connu sous le nom de recombinaison homologue). En utilisant des souches Hfr avec des plasmides F intégrés portant différents allèles de divers gènes, et en contrôlant la durée de conjugaison (séparant les cellules en les plaçant dans un mixeur de cuisine), les expérimentateurs ont pu déterminer l'ordre des gènes le long du chromosome. Le résultat fut la découverte que les organismes apparentés avaient les mêmes gènes disposés dans le même ordre. Le dessin typique du chromosome bactérien circulaire est comme une horloge allant de 0 à 100, avec les gènes placés dans leurs positions respectives, en fonction du temps qu'il faut pour les transférer (en minutes). Ceci est un exemple de synténie, c'est-à-dire la conservation de l'ordre des gènes le long d'un chromosome266. Nous reviendrons bientôt sur Synteny.

Si toute la séquence du plasmide F est transférée, la cellule F d'origine devient une cellule Hfr. Si la cellule Hfr perd la séquence du plasmide F, elle revient à un état F. Le résultat final du processus de conjugaison est similaire à celui obtenu dans la reproduction sexuée chez les eucaryotes (voir ci-dessous), à savoir que la cellule F originale a maintenant un génome dérivé en partie d'elle-même et de la cellule souche Hfr «donneuse».


En utilisant les valeurs Ka du tableau 9.6, calculez le pH d'un tampon qui contient les concentrations données d'un acide faible et de sa base conjuguée. a.0,55 M CH3COOH et 0,55 M NaCH3COO

En utilisant le Kune valeurs du tableau 9.6, calculez le pH d'un tampon qui contient les concentrations données d'un acide faible et de sa base conjuguée.

a.0,55 MCH3COOH et 0,55 M NaCH3ROUCOULER

Amortir Acide faible Base conjuguée Kune
Acide acétique/acétate CH3COOH CH3COO - 1.8 × 10 − 5
Bicarbonate/carbonate HCO3 CO3 2 − 5.6 × 10 − 11
Dihydrogénophosphate/hydrogénophosphate H2Bon de commande4 HPO4 2 − 6.2 × 10 − 8
Hydrogénophosphate/phosphate HPO4 2 − Bon de commande4 3 − 2.2 × 10 − 13


Matériaux|méthodes

Cellules de B. truncatella ont été obtenus auprès de la Carolina Biological Supply Company (Burlington, NC, USA) et des cellules de C. magna ont été obtenus auprès de l'American Type Culture Collection (#50128). Des cultures clonales ont été établies et cultivées dans de l'eau de Volvic avec des grains de blé et Klebsiella sp. B. truncatella les cultures ont également inclus Paramécie sp. Les cellules individuelles ont été prélevées avec une pipette et lavées trois fois dans de l'eau de Volvic stérilisée, puis laissées à mourir de faim pendant 48 h. Dix cellules affamées de chaque espèce ont été individuellement amplifiées génome entier avec REPLI-g Mini Kit (Hilden, Allemagne) en suivant les instructions du fabricant. Pour chaque espèce, les dix produits amplifiés du génome entier ont été combinés à des concentrations d'ADN égales.

ADN amplifié de B. truncatella a été séquencé avec la chimie Illumina MiSeq v2 (13 288 644 lectures de 2 × 250 pb) et la chimie Illumina HiSeq v3 113 546 269 lectures de 2 × 150 pb). ADN amplifié de C. magna a été séquencé avec la chimie MiSeq v3 (18 770 554 lectures de 2 × 300 pb) et la chimie HiSeq v3 (28 298 554 lectures de 2 × 150 pb). Comme les tailles du génome de ces deux espèces sont inconnues, nous n'avons pas pu estimer la couverture du séquençage. La longueur k-mer optimale pour l'assemblage du génome a été recherchée dans une plage de 21 à 201 avec KmerGenie v1.6976 ( Chikhi et Medvedev 2014), en utilisant le paramètre « diploïde ». Les génomes ont ensuite été assemblés avec Minia v2.0.7 ( Chikhi et Rizk 2012), en fixant l'abondance minimale de kmer à 5. Les contigs obtenus ont ensuite été analysés avec AUGUSTUS v2.7 ( Stanke et al. 2004) pour une annotation structurelle, en utilisant ce qui suit paramètres : la recherche sur les deux brins du génome est partielle prédire les gènes indépendamment sur chaque brin, permettre le chevauchement des gènes sur les brins opposés signaler les transcriptions avec les codons d'arrêt dans le cadre des espèces définies sur le cilié T. thermophila. Les lectures ont été déposées dans les archives de lecture de séquence de GenBank sous les numéros de BioProject PRJNA381863 et PRJNA382551.

Une base de données de requêtes de 11 gènes spécifiques à la méiose et de 40 gènes liés à la méiose d'eucaryotes ciliés et non ciliés a été établie à l'aide de la littérature et des recherches par mot-clé de la base de données de protéines NCBI ont été extraites de Chi et al. (2014a). Pour REC8, nous avons utilisé des séquences eucaryotes canoniques et T. thermophilaest non canonique REC8 ( Howard-Till et al. 2013). Les ORF des deux colpodéens ont été recherchés par la base de données de requête en utilisant BlastP ( Altschul et al. 1990) et HMMER v3.0 ( Eddy 2001). Coups avec ELes valeurs <10 -4 pour la séquence complète ont été retenues. La vérification des homologues candidats a utilisé une recherche BlastP réciproque par rapport à la base de données de séquences de protéines non redondantes du NCBI (fichiers supplémentaires 1 et 2, matériel supplémentaire en ligne).

Afin de déterminer la force de la sélection purificatrice agissant sur les gènes méiotiques inventoriés, nous avons mesuré ω = dN/dS, le nombre de substitutions non synonymes par site non synonyme divisé par le nombre de substitutions synonymes par site synonyme. Les séquences générées à partir de cette étude ont été alignées avec des séquences homologues identifiées à partir de T. thermophila, P. tetraurelia, Ichthyophthirius multifiliis, et Oxytricha trifallax par Chi et al. (2014a). Les séquences ont été alignées dans Geneious v4.8.3 ( Kearse et al. 2012) en utilisant Translation Align avec ClustalW v2 ( Larkin et al. 2007). Les séquences qui n'avaient pas suffisamment de chevauchement avec les autres gènes, n'étaient pas alignables ou étaient considérées comme paralogues aux gènes de ces autres espèces ont été exclues d'une analyse plus approfondie (tableau supplémentaire 1, matériel supplémentaire en ligne). Les généalogies de probabilité maximale de chaque gène ont été déduites avec MEGA7 ( Kumar et al. 2016), et les taux de sous-stations synonymes et non synonymes ont été estimés avec PAML v4.8 ( Yang 2007). ω a d'abord été calculé entre B. truncatella et C. magna. Ensuite, toutes les espèces ont été incluses pour tester si la lignée menant à C. magna présentaient des valeurs plus élevées de , ce qui serait attendu si ces gènes n'étaient plus fonctionnels et connaissaient ainsi une sélection relâchée. En utilisant codeml, nous avons comparé un modèle d'évolution avec une valeur de pour l'arbre entier (modèle = 0) à un modèle où le C. magna la lignée avait une valeur distincte de (modèle = 2). Un test du rapport de vraisemblance logarithmique a été utilisé pour déterminer si le deuxième modèle offrait un meilleur ajustement aux données.


Les coccolithophores tels que Emiliania huxleyi montré ici sont du phytoplancton marin unicellulaire qui produit des écailles de carbonate de calcium (coccolithes). Ils sont présents dans tous les océans du monde et représentent ensemble la plus grande source de carbonate de calcium biogénique sur Terre, contribuant de manière significative au cycle mondial du carbone. Les coccolithes, qui sont produits à l'intérieur des cellules, sont sécrétés à la surface des cellules. La découverte de canaux de protons dans la membrane cellulaire des coccolithophores fournit de nouvelles informations sur la façon dont ils font face aux excès de protons générés pendant la calcification et éclairera les futures études sur la façon dont ces organismes importants réagiront à l'acidification des océans (voir Taylor et al., e1001085).

Crédit d'image : Alison R. Taylor (Installation de microscopie de l'Université de Caroline du Nord à Wilmington)

Citation: (2011) Biologie PLoS Image du problème | Vol. 9(6) juin 2011. PLoS Biol 9(6) : ev09.i06. https://doi.org/10.1371/image.pbio.v09.i06

Publié : 28 juin 2011

Droits d'auteur: © 2011 Taylor. Il s'agit d'un article en libre accès distribué selon les termes de la licence d'attribution Creative Commons, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'auteur et la source d'origine soient crédités.


Constante d'ionisation de base, Kb

Constante d'ionisation de base (Kb) – la constante d'équilibre pour l'ionisation d'une base aussi appelée la constante de dissociation de base .

L'équation générale de la réaction d'une base, B, avec l'eau :

B (aq) + H2O (l) ⇌ BH + (aq) + OH - (aq)

Les bases de Bronsted-Lowry réagissent avec l'eau pour produire des ions OH - (aq) et un acide conjugué, qui ensemble déterminent les propriétés acido-basiques de la solution aqueuse.

Bases faibles, comme les acides faibles, forment des équilibres dynamiques dans les solutions aqueuses.

Pour la réaction d'une base générique avec l'eau, l'équation de la loi d'équilibre, K, s'écrit comme suit :

Puisque la concentration (densité) de l'eau est une constante, elle peut être incorporée dans la valeur de K (comme c'était le cas dans l'équation de la loi d'équilibre pour Kune).

Cela donne une nouvelle constante, Kb, appelé le constante d'ionisation basique:

Les bases faibles sont les bases conjuguées des acides faibles.

Par exemple, l'ion éthanoate, C2H3O2 - (aq), est la base conjuguée de l'acide éthanoïque, HC2H3O2 (aq). De même, l'ion hypochlorite, ClO - (aq), est la base conjuguée de l'acide hypochloreux, HClO(aq).


Conseils pratiques d'ELISA

Les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) combinent la spécificité des anticorps avec la sensibilité des dosages enzymatiques simples, en utilisant des anticorps ou des antigènes couplés à une enzyme facilement dosable. Les ELISA peuvent fournir une mesure utile de la concentration d'antigène ou d'anticorps. Étant l'un des tests immunologiques les plus sensibles, ELISA offre une valeur commerciale dans la recherche en laboratoire, le diagnostic des biomarqueurs de maladies et le contrôle qualité dans diverses industries.

Il existe différents types d'ELISA selon la méthode de détection de l'analyte. Chacun d'eux a son propre protocole mais le principe de base est similaire. Un ELISA est généralement une procédure en cinq étapes :
1) Revêtement d'antigène
2) Bloquer tous les sites non liés pour empêcher l'absorption non spécifique
3) Ajouter l'analyte et l'incubation
4) Ajouter des anticorps marqués et incubation
5) Ajouter des réactifs de coloration/luminescence, ainsi donner un résultat positif.

Nous avons déjà discuté du format ELISA et du protocole général dans ELISA Guide et ELISA Development Guide. Ici, nous discutons principalement de certaines connaissances de base et de conseils pratiques pendant le processus de fonctionnement d'ELISA. Si vous avez besoin de plus d'informations sur le kit ELISA commercial, veuillez visiter notre produit du kit ELISA.

2. Plaque ELISA (phase solide)

Il existe différents types de phase solide qui peuvent être utilisés pour l'ELISA, tels que la membrane, la plaque à puits et les billes. Leurs caractéristiques sont décrites dans le tableau 1 suivant.

Tableau 1. Types de phases solides de dosage immunologique

Matériela Capacité de reliure Type d'interaction
Membrane
Nitrocellulose
PVDF
Nylon

Haute
Haute
Haute

Hydrophobe, Hydrophile
Hydrophobe
Hydrophobe
Plaques et tubes
polystyrène
Polyvinyle

Meugler
Meugler

Hydrophobe
Hydrophobe
Perles
polystyrène
Polystyrène dérivé
Microparticules

Modérer
Haute
Haute

Hydrophobe
Covalent, Hydrophobe, Hydrophile
Covalent et Hydrophobe

Le plus souvent, les ELISA sont effectués dans des plaques à 96 puits (ou 384 puits). La plupart des plaques sont soit en polystyrène, soit en dérivés de polystyrène obtenus par modification chimique ou irradiation de la surface. La protéine de capture peut être soit absorbée passivement à la surface d'une plaque de polystyrène, soit couplée de manière covalente par des modifications qui laissent des groupes aminés ou réactifs tels que des groupes maléimide, hydrazine ou N-oxysuccinimide à la surface (figure 1). C'est cette liaison et cette immobilisation des réactifs qui rendent ELISA si facile à concevoir et à réaliser. Le fait d'avoir les réactifs de l'ELISA immobilisés à la surface de la microplaque facilite la séparation du matériel lié du matériel non lié pendant l'essai. Cette capacité à éliminer les matériaux non spécifiquement liés fait de l'ELISA un outil puissant pour mesurer des analytes spécifiques dans une préparation brute.

Figure 1. La chimie de surface de la plaque de polystyrène et de la protéine immobilisée.

Le polystyrène se lie à une grande variété de protéines en quantité croissante en fonction de leur concentration dans la solution de revêtement. La quantité spécifique et optimale doit être déterminée pour chaque protéine. Les glucides et les protéines fortement glycosylées ne s'adsorbent pas bien au polystyrène par les forces décrites ci-dessus car ils ont très peu de capacité à participer aux interactions hydrophobes. Pour faire adhérer ces molécules, il faut recourir aux liaisons covalentes.

Un certain nombre de modifications ont été apportées à la surface en polystyrène qui permettent la liaison covalente des molécules à la surface en plastique (figure 1c). Les groupes maléimide réagissent avec un sulfhydryle formant une liaison covalente entre la surface plastique et une protéine ou un peptide. L'hydrazine réagit avec les aldéhydes générés par l'oxydation des hydrates de carbone au périodate. Le N-hydroxysuccinimide (NHS) réagit avec les amines sur les peptides ou les protéines. Peptides soit par l'extrémité COOH en utilisant un agent de réticulation tel que le carbodiimide, soit par l'intermédiaire de l'amine en utilisant un agent de réticulation homobifonctionnel tel que le disuccinimidyl subérate (DSS). Le tableau 2 montre la méthode recommandée pour immobiliser différents antigènes sur plaque de polystyrène.

Tableau 2. Différents antigènes et leur méthode d'immobilisation recommandée.

Adsorption directe Liaison covalente
Protéines
Peptides plus longs que 15-20 acides aminés
Epitopes de petites molécules attachés à une protéine
Bactéries et virus
Protéines fortement glycosylées
Protéines en présence de détergents
Les glucides
Peptides courts
Lipides
ADN

3. Revêtement d'antigène

Une caractéristique clé de l'ELISA sur plaque est que la protéine de capture (anticorps ou antigène) peut être facilement fixée aux surfaces par adsorption passive ou liaison covalente. Ce processus est communément appelé revêtement. De multiples facteurs affectent le processus de revêtement antigénique. Le taux et l'étendue du revêtement dépendent principalement des facteurs suivants :
? Coefficient de diffusion de la molécule d'attache
? Rapport de la surface à enduire au volume de la solution de revêtement
? Concentration de l'antigène adsorbé
? Température
? Temps d'adsorption

Ces facteurs sont liés. Il est très important de déterminer la concentration optimale de revêtement d'antigène pour chaque système. Le temps et la température sont également des facteurs importants contrôlant la quantité de protéines adsorbées. Une plage de concentration de 1 à 10 g/mL de protéine, dans un volume de 50 à 100 L, est un bon indicateur du niveau de protéine nécessaire pour saturer les sites disponibles sur une plaque de polystyrène. Les solutions de revêtement couramment utilisées sont : 50 mM de carbonate, pH 9,6 20 mM de Tris-HCl, pH 8,5 et 10 mM de PBS, pH 7,2. L'adsorption la plus complète et la variation de puits à puits la plus faible se produisent pendant la nuit (16 à 18 heures) à 4 °C avec les puits scellés pour empêcher l'évaporation. Le temps d'adsorption peut être accéléré par une incubation à température ambiante pendant 4 à 8 heures ou à 37 °C pendant 1 à 4 heures. Il existe de nombreuses autres variantes et, en fin de compte, chaque scientifique doit titrer un antigène particulier pour obtenir un régime standardisé. Après le processus de revêtement, n'oubliez pas de retirer la solution de revêtement et de laver la plaque en remplissant les puits avec 200 l de PBS 3 fois. Retirez ensuite les solutions de lavage en effleurant doucement la plaque au-dessus d'un évier. Retirez les gouttes restantes en tapotant la plaque sur une serviette en papier.

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4. Processus de blocage

Le revêtement des puits avec le partenaire de liaison spécifique, antigène ou anticorps, laisse des sites hydrophobes inoccupés sur le plastique. Ces sites doivent être bloqués afin d'empêcher la liaison non spécifique des réactifs ultérieurs. Si cela n'est pas réalisé efficacement, le test souffrira d'un signal de fond élevé et d'une spécificité et d'une sensibilité réduites (Figure 2). Ces bloqueurs agissent en réduisant la liaison non spécifique pour augmenter le rapport signal/bruit. Pour empêcher la liaison non spécifique, des tampons de blocage sont utilisés après l'étape de revêtement en phase solide pour bloquer tous les sites de liaison ouverts restants.

Les réactifs de blocage sont typiquement choisis de manière empirique. Le bloqueur optimal pour un test peut ne pas donner de bons résultats dans d'autres tests. Les deux principales classes d'agents bloquants qui ont été testés sont les protéines et les détergents.

Figure 2. Plaque ELISA avec et sans processus de blocage.

Les détergents se divisent en trois classes : non ioniques, ioniques et zwitterioniques. Les ions ioniques et zwitterioniques ne sont pas recommandés comme bloqueurs car ils perturbent les interactions hydrophobes qui lient les protéines enduites à la surface du plastique. Typiquement, les détergents utilisés comme réactifs de blocage sont non ioniques tels que le Tween 20 et le Triton X-100. Les détergents sont considérés comme des bloqueurs temporaires, ils ne constituent pas une barrière permanente à la fixation des biomolécules à la surface car leur capacité de blocage peut être éliminée par lavage avec de l'eau ou un tampon aqueux. Contrairement aux détergents non ioniques, les protéines sont des bloqueurs permanents et ne doivent être ajoutées qu'une seule fois après que la surface est recouverte de la molécule de capture. Certains des bloqueurs de protéines les plus couramment utilisés sont répertoriés dans le tableau 3 ainsi que leurs avantages et inconvénients.

Tableau 3. Avantages et inconvénients des bloqueurs de protéines couramment utilisés.

Les agents bloquants idéaux ont les caractéristiques suivantes :
? Bloque efficacement la liaison non spécifique des réactifs de dosage à la surface du puits
? Ne pas perturber la liaison des composants du test qui ont été adsorbés dans le puits
? Agir comme stabilisant (éviter la dénaturation) des réactifs de dosage sur la phase solide
? Ne pas provoquer de réaction croisée avec d'autres réactifs du test
? Ne possèdent pas d'activité enzymatique qui pourrait contribuer à la génération de signaux du substrat ou à la dégradation des réactifs
? Effectuer de manière cohérente sur différents lots

5. Préparation d'anticorps

Les anticorps étant la pierre angulaire du test ELISA, le choix des anticorps est évidemment primordial. Le problème le plus fréquemment rencontré est de savoir comment choisir un anticorps, monoclone (MAb) ou polyclone (PAb) ? En général, un MAb est souvent choisi comme anticorps primaire pour établir le plus haut niveau de spécificité dans un essai, et un PAb est choisi comme anticorps secondaire, pour amplifier le signal via de multiples événements de liaison. Cependant, n'importe quelle combinaison peut être utilisée. Tous les anticorps candidats doivent être testés avec le type d'échantillon prévu afin de sélectionner les meilleurs.

L'anticorps primaire/secondaire doit être dilué dans une solution de blocage pour aider à empêcher la liaison non spécifique. Une concentration de 0,1 à 1,0 g/ml est généralement suffisante.

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Tableau 4. Principales différences de performance entre MAb et PAb

Anticorps monoclonaux (MAb) Anticorps polyclonaux (PAb)
une. Généralement produits chez la souris ou de manière recombinante, ces anticorps reconnaissent un seul épitope.
b. Étant donné qu'une seule molécule d'anticorps peut se lier à l'antigène, l'interaction est hautement spécifique mais peut manquer de sensibilité.
une. Produit chez les chèvres, moutons, poulets, lapins et autres animaux.
b. Les sérums polyclonaux sont un composite hétérogène d'anticorps avec des spécificités uniques et la concentration d'anticorps spécifiques (PAb) est généralement de 50 à 200 mg/mL.
c. Les PAbs sont capables de reconnaître plusieurs épitopes sur n'importe quel antigène, ce qui les rend moins sensibles aux changements mutationnels de l'antigène.
ré. Les PAb sont utiles lorsque la nature de l'antigène n'est pas bien connue. Cependant, leur quantité est limitée par la durée de vie de l'animal.

6. Préparation de l'échantillon

Les échantillons contiennent les principaux analytes que nous devons détecter par ELISA. Une excellente préparation de la solution échantillon peut améliorer la qualité du test ELISA. Le type d'échantillon peut être varié tel que sérum, plasma, urine, lysats cellulaires ou tissulaires, salive, lait, surnageant de culture cellulaire, etc. Chaque échantillon peut nécessiter un processus de préparation spécifique. Un protocole général pour la préparation des échantillons comme suit :
une. La concentration d'extrait protéique est d'au moins 1-2 mg/mL.
b. Les extraits cellulaires et tissulaires sont dilués à 50 % avec du tampon de liaison.
c. Les échantillons sont centrifugés à 10 000 tr/min pendant 5 min à 4°C pour éliminer tout précipité avant utilisation.

Et pour chaque détail d'échantillon, voir le tableau 5.

Tableau 5 Types d'échantillons ELISA couramment utilisés et leurs traitements.

Échantillons Traitements
Sérum Recueillir le sang total dans un tube sans additifs Conserver à température ambiante pendant 20 minutes. Centrifuger 10 minutes à 3000 rpm. Aliquoter dans de petits tubes et conserver à -80°C jusqu'à utilisation. Minimiser les cycles de gel/dégel.
Plasma Recueillir le sang total dans un tube EDTA, Citrate ou Héparine de sodium Centrifuger 10 minutes à 3 000 tr/min à 4°C Aliquoter dans de petits tubes et conserver à -80°C jusqu'à utilisation. Minimiser les cycles de gel/dégel.
Urine Recueillir l'urine sans ajouter de stabilisants. Centrifuger les échantillons dur (par exemple 10 000 x g pendant 1 min ou 5 000 x g pendant 2 min). Aliquoter, congeler rapidement dans un bain de glace carbonique/méthanol et conserver à -80°C jusqu'à utilisation.
Salive Recueillir des échantillons et centrifuger à 10 000 x g pendant 2 min à 4°C. Aliquoter le surnageant et conserver les échantillons à -80°C. Minimiser les cycles de gel/dégel.
Lysats cellulaires Placer les plaques de culture tissulaire sur la glace. Retirez le support et lavez délicatement les cellules une fois avec du PBS glacé. Retirer le PBS et ajouter 0,5 ml de tampon d'extraction par plaque de 100 mm. Inclinez la plaque et grattez les cellules dans un tube pré-refroidi. Vortex brièvement et incuber sur de la glace pendant 15-30 min. Centrifuger à 13 000 tr/min pendant 10 min à 4°C (cela crée un culot à partir du contenu insoluble). Aliquoter le surnageant dans des tubes propres et réfrigérés (sur de la glace) et conserver les échantillons à -80°C, en évitant les cycles de gel/dégel.
Lysats tissulaires Disséquer le tissu d'intérêt avec des outils propres, sur de la glace de préférence et aussi rapidement que possible pour éviter la dégradation par les protéases. Placez le tissu dans des tubes de microcentrifugation à fond rond et plongez-le dans de l'azote liquide pour le "geler". Conserver les échantillons à -80°C pour une utilisation ultérieure ou conserver sur de la glace pour une homogénéisation immédiate. Pour un

7. Solution tampon

Il existe 5 solutions tampons principalement utilisées dans le test ELISA : le tampon de revêtement, le tampon de blocage, le tampon de lavage, le tampon de substrat et le tampon d'arrêt.

Tampon de revêtement généralement tampon carbonate 0,05 M avec pH = 9,6.

Tampon de revêtement Tampon de blocage Tampon de lavage Tampon de substrat Arrêter le tampon
Tampon carbonate 0,05M, pH=9,6 Voir le tableau 3 0,01 M PBS-Tween 20, pH = 7,4 Tampon acide phosphorique-citrique, pH=5,0 2M H2DONC4
N / A2CO3 1.59g NaCl 8g 0.2M Na2HPO4 25,7 ml
NaHCO3 2.93g KH2Bon de commande4 0.5g Acide citrique 0,1 M 24,3 ml
ddH2O 1000mL N / A2HPO4 2.9g ddH2O 50 ml
ajuster le pH à 9,6 Entre 20 et 20 0,5 ml OPD (Substrat) 4mg
stockage à 4°C ddH2O ajouter à 1000mL 30% H2O2 0,015 ml

8. Étapes de lavage

Les incubations qui sont effectuées dans un ELISA permettent à des interactions spécifiques de haute affinité de se former entre les réactifs. En lavant plusieurs fois entre chaque incubation, les réactifs en excès sont dilués à un niveau de fond indétectable. Afin de diluer efficacement les réactifs en excès, il est nécessaire de laver 3 à 5 fois après chaque incubation. C'est aussi une bonne idée de permettre un trempage de 5 à 10 minutes avec un tampon de lavage à chaque étape de lavage. Si les étapes de lavage sont effectuées à la main, tapotez l'excès de tampon de lavage à chaque étape en frappant la plaque à l'envers sur des serviettes en papier sèches. Ne laissez pas la plaque sécher pendant des périodes prolongées entre les étapes de lavage car cela peut entraîner une réduction de l'activité.

9. Analyse des données

Le test ELISA produit trois types différents de sortie de données :

? Quantitatives : les données ELISA peuvent être interprétées par rapport à une courbe standard (une dilution en série d'un antigène connu et purifié) afin de calculer avec précision les concentrations d'antigène dans divers échantillons.
? Qualitatif : les ELISA peuvent également être utilisés pour obtenir une réponse par oui ou par non indiquant si un antigène particulier est présent dans un échantillon, par rapport à un puits blanc ne contenant aucun antigène ou un antigène de contrôle non apparenté.
? Semi-quantitatif : les ELISA peuvent être utilisés pour comparer les niveaux relatifs d'antigène dans les échantillons de dosage, car l'intensité du signal variera directement avec la concentration en antigène.

Les données ELISA sont généralement représentées graphiquement avec la densité optique en fonction de la concentration logarithmique pour produire une courbe sigmoïde. Des concentrations connues d'antigène sont utilisées pour produire une courbe standard, puis ces données sont utilisées pour mesurer la concentration d'échantillons inconnus par comparaison à la partie linéaire de la courbe standard (figure 3).


Méthodes

Antigènes

L'albumine de sérum bovin (BSA) était une protéine purifiée naturelle obtenue auprès de Fluka, USA. Venin brut de cobra (Naja kaouthia) et la vipère verte (Trimeresurus albolabris) ont été achetés auprès de la Croix-Rouge thaïlandaise, Thaïlande. L'aflatoxine B1-BSA conjuguée et l'aflatoxine B1 soluble (Sigma, Allemagne) ont été préparées à partir de Aspergillus flavus. L'enzyme amylase de type XII-A (Sigma, Allemagne) a été préparée à partir de Bacillus licheniformis. La souche vaccinale contre la rage Flury LEP (Chiron Behring, Inde) était des virus de la rage inactivés qui ont été cultivés dans des cellules de fibroblastes primaires de poulet. Cholangiocarcinome, lignée cellulaire (KKU-100), qui est un œuf prouvé Opisthorchis-le cholangiocarcinome associé dérivé de cellules hépatiques porta [68], était un don du Dr Banchob Sripa.

Construction du vecteur phagemide pMod1

Le vecteur phage 3.2 (Maxim Biotech Inc, USA) a été utilisé comme base pour la construction du vecteur phagemide pMod1. Le nouveau vecteur contient Sfimoi et PasI sites de restriction et comprend une étiquette hexahistidine et une étiquette Myc. Deux oligonucléotides, Mod1up (5' TCG ACC CAT GGC TCG AGG CGG CCG CAC ATC ATC ATC ACC ATC ACG GGG CCG CAG GGC C 3') et Mod1dn (5' CT GCG GCC CCG TGA TGG TGA TGA TGA TGT GCG GCC GCC TCG AGC CAT GGG 3') ont été annelés et ligaturés dans le vecteur du phage 3.2 (figure 1) pour la génération de pMod1. L'insertion a été faite à ApaJE/SalI sites utilisant l'ADN ligase T4 (NEB, USA). Le vecteur pMod1 fini a été amplifié par transformation E. coli DH5αF', et l'ADN du phagemide a été préparé par un kit d'extraction miniprep (Qiagen, Allemagne). L'intégrité du plasmide a été confirmée par analyse automatisée de la séquence d'ADN (Macrogen, Corée).

Construction d'une bibliothèque de phages scFv humains

Génération du répertoire de gènes scFv

Les dons de sang périphérique de cent quarante donneurs sains et non immunisés ont été collectés en quatre pools, selon différents groupes sanguins. Ces échantillons de sang ont été testés négatifs et évacués de l'unité de don de sang de la Croix-Rouge thaïlandaise dans la province de Nakhon Ratchasima. L'ARN total a été préparé à partir des lymphocytes B et rassemblés. Environ 2 ml d'échantillons sanguins de chaque donneur ont été collectés en quatre pools, selon différents groupes sanguins (groupes sanguins A, B, O et AB). Ainsi, un total d'environ 280 ml d'échantillon de sang a été utilisé. Les lymphocytes B ont été isolés du sang périphérique en utilisant le réactif de plaque de Ficoll (Amersham, USA). En bref, l'échantillon de sang dilué (1:1 de sang par PBS) a été soigneusement déposé sur le réactif de plaque de Ficoll, puis la solution à deux phases a été centrifugée à 400 × g pendant 30 minutes. Des lymphocytes B ont été collectés à l'interface entre les deux phases. La contamination de l'interface telle que les plaquettes et les protéines plasmatiques a été éliminée par lavage avec du PBS. L'ARN total a été extrait des lymphocytes B par le réactif TRIzol (Invitrogen, USA). Les lymphocytes B ont été remis en suspension dans 1 ml de TRIzol et incubés à 65°C pendant 15 minutes avec une inversion occasionnelle du tube. Après avoir ajouté 0,2 ml de chloroforme, le tube a été vortexé pendant 15 secondes puis centrifugé à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4°C. La phase aqueuse a été transférée dans un nouveau tube contenant 1 l de RnaseOut (40 U/μl, Invitrogen, USA), et 0,5 ml d'isopropanol a été ajouté pour précipiter l'ARN. Le tube a été incubé à température ambiante pendant 10 minutes. L'ARN précipité a été sédimenté par centrifugation à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4°C. Le culot a été lavé avec 0,5 ml d'éthanol à 75 % puis centrifugé à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4°C. Après élimination du surnageant, le culot a été séché à l'air pendant 5 minutes à température ambiante et dissous dans de l'eau désionisée stérile. Ensuite, 1 l de RnaseOut (40 U/μl, Invitrogen, USA) a été ajouté à l'ARN total et conservé à -70°C. L'ADNc du premier brin a été généré à partir de 10 g d'ARN total, en utilisant la transcriptase inverse MMuLV (NEB, USA) avec un mélange de 20 M d'oligo-dT18 et 8 ng d'amorce hexamère aléatoire. Les gènes des régions variables de la chaîne lourde, de la chaîne légère et de la chaîne légère (VH, V??, et V??) ont été amplifiés séparément et recombinés par trois réactions PCR ultérieures. Le premier ensemble de PCR se compose de 75 réactions indépendantes pour générer des domaines variables des chaînes lourdes et légères. Les amorces de chaîne lourde 5' ont été conçues pour inclure un SfiI site, et les amorces de chaîne légère 3' comprennent un Pasje site. Les amorces de chaîne légère 5' ont été conçues pour inclure une partie de la région de liaison (Gly4Ser)3 et compatible avec les amorces de chaîne lourde 3' (tableau 1). Chaque gène de région variable a été amplifié séparément en utilisant une PCR de démarrage à chaud dans une réaction de 50 ul contenant 5 ul d'ADNc et 1 uM de chaque amorce 5' et 3'. Cette réaction a été réalisée en utilisant le Taq polymérase (NEB, USA). Les échantillons ont été chauffés à 94°C pendant 5 min, suivis de 35 cycles de 94°C pendant 1 min, 55–65°C pendant 1 min, 72°C pendant 2 min. L'extension finale a été réalisée à 72°C pendant 10 min. Une quantité égale de produits PCR a été regroupée dans des collections de VH, V??, et V?? répertoire de gènes, et purifié à partir du gel d'agarose à basse température de fusion selon le protocole standard [69]. Dans la deuxième PCR, les chaînes lourdes et légères ont été assemblées et amplifiées en utilisant pfu ADN polymérase (Promaga, États-Unis). La réaction PCR d'assemblage contenait un mélange molaire égal de la masse lourde (VH) ADN et lumière regroupée (V??, ou V??) répertoire de gènes. La réaction d'assemblage a été cyclée 5 fois (94°C pendant 45 s, 60°C pendant 50 s et 72°C pendant 60 s) sans amorces. La troisième réaction a créé un répertoire de gènes scFv de pleine longueur à partir de la deuxième PCR par amplification PCR en présence d'amorces pull-through. Cette PCR a étendu le gène scFv du Sfimoi et PasI sites flanquant les gènes scFv, en utilisant les amorces suivantes : PTfw (5'-CCT TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3') et PTrv (5'-CAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG-3'). La réaction a été effectuée en utilisant le Taq polymérase et 1 l de produits assemblés de la deuxième PCR. Cette PCR pull-through a été cyclée 30 fois (94°C pendant 1 min, 60°C pendant 1 min, 72°C pendant 2 min) et une extension finale à 72°C pendant 10 min. Ensuite, les échantillons ont été purifiés par un kit de purification QIAquick PCR (QIAGEN, Allemagne) pour l'étape suivante.

Clonage du scFv dans le vecteur pMod1

L'ADN scFv amplifié et le vecteur phagémide pMod1 ont été successivement digérés avec Pasmoi et SfiI, en incubant dans des conditions appropriées pendant 10 heures. Le vecteur coupé a ensuite été déphosphorylé avec de la phosphatase intestinale de veau (NEB, USA) et purifié sur gel en utilisant le Wizard® DNA Clean-Up System (Promega, USA) avant ligature. Un total de 2,8 pg d'ADN scFv digéré a été ligaturé dans 5,5 pg de vecteur phagémide pMod1, à un rapport molaire vecteur: insert de 1:3, pour générer la banque de fusion scFv-gène III. La ligature a été effectuée en utilisant l'ADN ligase T4 (NEB, USA) pendant une nuit à 16°C. Les populations d'ADN ligaturées ont été électroporées dans Escherichia coli (E. coli) TG1 (Maxim Biotech Inc, USA) en utilisant un électroporateur Eppendrof 2510 (Eppendrof, USA). Les cellules transformées ont ensuite été incubées pendant 1 heure à 37°C avant d'être étalées sur une plaque TYE contenant de l'ampicilline (100 µg/mL) et du glucose (1% w/v), la plaque a été incubée une nuit à 37°C. Complexity of the library was determined at this step by serially diluting the transformed cells and counting the number of colonies. Ligation efficiency was also determined by counting the number of colonies from no-insert ligation. Colonies were then collected, mixed with glycerol, and stored at -80°C. The library stock was grown to log phase and rescued with M13KO7 helper phage (Maxim Biotech Inc, USA). Recombinant phage preparations were purified and concentrated by polyethylene glycol (PEG) precipitation before keeping at -80°C.

Determination of library size

A total of 8.3 μg of DNA was electroporated in to E. coli TG1 to generate the scFv phage library. After electroporation the cuvette was flushed with 6 ml of SOC medium and transformed cells were incubated for 1 hour at 37°C before spreading on TYE plate containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v), then the plate was incubated overnight at 37°C. Complexity of the library was determined by serially diluting the transformed cells and counting the number of colonies. A volume of 100 μl from transformation reactions was taken and a four step 10-fold serial dilution was made. The 100 μl of each dilution was plated out. The appearance of 250 individual colonies from 10 4 dilution titer indicated a library diversity of 1.5 × 10 8 .

Selection of phage antibody library

Selection of phage particles displaying specific scFv fragments were performed on Immuno 96 MicroWell™ Plates (Nunc, Denmark). The different protein antigens (50–600 μg/ml) in phosphate-buffered saline (PBS) (or 0.1 mM NaHCO3, in case of amylase) were coated on the plates overnight at 4°C (in case of Rabies, the preparation was first incubated at 37°C for 2 hrs). For cholangiocarcinoma cell surface, approximately 5 × 10 5 cells growing in a 5-ml flask was used. Following blocking with 2% (w/v) skimmed milk powder in PBS (2% MPBS), a library containing between 10 11 and 10 12 phage particles were added and the plate was incubated for 2 hours at room temperature (RT 25–28°C). Non-bound phages were eliminated by washing 10–20 times with PBS containing 0.1% Tween 20 (PBS-T), followed by 10–20 times washing with PBS. The bound phages were eluted by incubation with 50 μl of 1 μg/μl trypsin for 10 min, followed by 50 μl of 50 mM glycine- HCl pH 2.0 (immediately neutralized with 50 μl of 200 mM NaHPO4, pH7.5 after 10 min). Eluted phages were used to infect exponentially growing E. coli TG1 cells by incubating for 30 min at 37°C. Infected cells were spread on TYE plate containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v), then the plate was incubated overnight at 37°C. Individual phage-infected colonies were picked and grown for production of phagemid particles in 96-well plate. The culture was rescued using either M13KO7 or KM13 helper phage (MRC HGMP Resource Centre, Cambridge, UK) as describe elsewhere [55]. Rescued phage particles were used to test their antigen recognition properties by ELISA or to initiate subsequent rounds of selection using the similar conditions. Between one and two rounds of selection were performed for each antigen.

ELISA screening of selected clones

In order to detect antigen recognition, Immuno 96 MicroWell™ Plates were coated with approximately 5–200 μg/ml of each antigen. For cholangiocarcinoma, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde in 96-well tissue culture plate. After overnight incubation at 4°C, plates were blocked with 2% MPBS for 1 hour at RT followed by three washes with PBS. The selected phage preparation was diluted 1:2 in 4% MPBS before adding into each well, and incubated for 1 hour at RT. The plates were washed three times with PBS-T, followed by three times with PBS, and incubated with a 1:5,000 dilution of a mouse anti-M13 phage-horseradish peroxidase (HRP) conjugate (Amersham-Pharmacia Biotech, Sweden) in 2% MPBS. The plates were washed again as described earlier. The ABTS (2,2-azino-di-3-ethyl-benzthiazoine-6-sulfonate) peroxidase substrate (Fluka, USA) was added, and the absorbance was read at 405 nm, using a Sunrise absorbance reader (TECAN, Austria).

Inhibition ELISA

The inhibition ELISA was performed as described in the normal ELISA method, except that the phage particles were pre-incubated in the presence of increasing amount of soluble Aflatoxin B1 from 0.039–5.0 μg/ml.

DNA fingerprint analysis and DNA sequencing

The diversity of the selected scFv clones was analyzed by comparing restriction enzyme digestion patterns, a procedure called DNA fingerprinting. The scFv sequence of individual clones was amplified by PCR using the following primers: PTfw (5'-CCT TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3') and PTrv (5'-CAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG-3'). The amplified product was digested with a frequent cutting enzyme, BstNI (NEB, USA) and analyzed on 2% agarose gels. For DNA sequencing, plasmid DNA from different clones was purified using MiniPreps kit (QIAGEN, Germany) and the inserts were sequenced using the dideoxynucleotide chain-termination method with -96gIII primer (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'), corresponding to the vector sequence downstream of the scFv gene. After the amino acid sequences were translated, they were analyzed by using IgBLAST [36] and V BASE [34] software.

Soluble scFv antibodies production

E. coli HB2151 (Maxim Biotech Inc, USA) cells carrying the phagemid encoding the scFv antibody were grown in 10 ml of 2 × TY medium containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v). After reaching an OD600 of 0.9, cells were harvested and grown at 30°C in glucose free 2 × TY medium containing 100 μg/mL ampicillin and 0.1 mM isopropyl-μ-d-thiogalactopyranoside (IPTG). The cell culture supernatant containing scFv were collected after induction for 20 hours. In some case, the cell lysate containing scFv were extracted after induction for 6 hours.


Absolute Quantification of Drug Vector Delivery to the Cytosol

Macromolecular drugs inefficiently cross membranes to reach their cytosolic targets. They require drug delivery vectors to facilitate their translocation across the plasma membrane or escape from endosomes. Optimization of these vectors has however been hindered by the difficulty to accurately measure cytosolic arrival. We have developed an exceptionally sensitive and robust assay for the relative or absolute quantification of this step. The assay is based on benzylguanine and biotin modifications on a drug delivery vector of interest, which allow, respectively, for selective covalent capture in the cytosol with a SNAP-tag fusion protein and for quantification at picomolar sensitivity. The assay was validated by determining the absolute numbers of cytosolic molecules for two drug delivery vectors: the B-subunit of Shiga toxin and the cell-penetrating peptide TAT. We expect this assay to favor delivery vector optimization and the understanding of the enigmatic translocation process.

Biological macromolecules such as peptides, proteins or oligonucleotides hold great therapeutic potential. They enable indeed to target “undruggable” proteins which lack cavities for small molecule binding, or to stimulate the immune system by antigen cross-presentation. However, macromolecules do not readily cross membranes. Most remain trapped at the plasma membrane or in intracellular compartments and do not reach their targets in the cytosol. Cytosolic arrival, via direct translocation across the plasma membrane or endocytosis followed by endosomal escape, is currently one of the main bottlenecks for the development of new macromolecular therapeutics. 1-3

For the optimization of cytosolic delivery, the process must be quantified. 4 Existing assays for this have a number of limitations, including the failure to distinguish between cytosolic versus intraluminal localizations and a lack of sensitivity and robustness (Table S1). Of note, two recently developed assays, the Chloroalkane Penetration Assay 5 and the NanoClick assay 6 rely on the HaloTag protein, 7 which covalently reacts to chloroalkanes. The cytosolic localization of the HaloTag reporter protein ensures the cytosolic specificity of the assay. Both assays measure the non-reacted reporter protein fraction, which is inversely proportional to the extent of translocated molecules. This limits the assay sensitivity. Furthermore, these assays do not provide absolute quantification of translocated molecules. Therefore, the quantification of small amounts of molecules reaching the cytosol remains challenging.

The example of siRNAs for the downregulation of disease-related proteins might be chosen to illustrate this point. For an efficient therapeutical effect, it is estimated that 2000–4000 siRNA molecules need to reach the cytosol per cell. 8, 9 The sensitivity of a cytosolic arrival assay is thus essential to detect such low numbers of molecules per cell and to optimize existing or develop new delivery tools.

To address this challenge, we have designed the Cyto-SNAP assay. This assay is based on a cytosolic capture protein assembled from SNAP-tag and mNeonGreen. The SNAP-tag reacts covalently with the small molecule benzylguanine (BG). 10 A vector of interest (e.g., protein- or peptide-based drug delivery tools) modified with BG will react with the SNAP-tag only if the vector reaches the cytosol (Figure 1 a).

A robust, sensitive, and quantitative cytosolic arrival assay. a) Schematic representation of the Cyto-SNAP assay. Upon membrane translocation, the BG-modified vector encounters the cytosolic mNeonGreen-SNAP-tag protein with which it reacts covalently. mNeonGreen is exploited for immunoprecipitation on beads coated with anti-mNeonGreen nanobodies, and the biotin moiety for ELISA. b) Parental, polyclonal mNeonGreen expressing (NG) or monoclonal mNeonGreen-SNAP-tag expressing (NG-SNAP) HeLa cell lines were treated with fluorescent SNAP-tag ligand BG-647-SiR. SiR fluorescence was only observed on NG-SNAP cells, in which it was homogeneously distributed in the cytosolic space. c) Demonstration of the high efficiency of the SNAP-tag reaction. Lysate from NG-SNAP cells was incubated with excess benzylguanine–biotin (BG–biotin) ligand, followed by streptavidin pull-down. Western blotting analysis showed that the cell lysate was depleted of mNeonGreen-SNAP-tag protein, which was indeed recovered on beads. d) Demonstration that the mNeonGreen immunoprecipitation (IP) is complete. The mNeonGreen-SNAP-tag protein was totally recovered on mNeonGreen-Trap beads, which confirmed the efficacy of the immunoprecipitation. e) Sensitivity and linearity of the assay. Known amounts of STxB-BG-biotin conjugate C were added into NG-SNAP cell lysate, followed by incubation at 37 °C, mNeonGreen-SNAP-tag immunoprecipitation and ELISA development. The obtained standard curve was linear over a wide range of concentrations. Even low picomolar STxB-BG-biotin concentrations were robustly detected. f) Demonstration that non-reacted SNAP-tag protein is efficiently quenched before cell lysis. Intact NG-SNAP and NG cells were incubated for 30 min at 4 °C or 37 °C in presence or absence (Ø) of SNAP-Cell® Block reagent. The cells were then washed, lysed, and lysates were incubated at 4 °C with or without STxB-BG-biotin conjugate A. Both 37 °C and 4 °C block conditions gave ELISA signals comparable to background signal without STxB-BG-biotin incubation.

mNeonGreen, 11 the second part of the cytosolic capture protein, is used for high affinity immunoprecipitation on beads coated with anti-mNeonGreen nanobodies (low K of 2 n m ). In this way, BG-tagged vector that reacts with the SNAP-tag of the cytosolic capture protein can be isolated. Finally, a biotin conjugated to the vector serves for quantification by ELISA (Figure S1).

We chose to validate the assay using two different vectors: i) Residues 47–57 from the HIV TAT protein, 12 which is one of the best-studied cell-penetrating peptides, and ii) the B-subunit of Shiga toxin (STxB), a vector for cancer cell targeting and immunotherapy. 13 After binding to its receptor, the glycosphingolipid Gb3, STxB is internalized and follows the retrograde transport route to the endoplasmic reticulum. STxB was shown to be able to translocate to the cytosol 14 and to efficiently deliver antigens for antigen cross-presentation, 13 making it an interesting model for a cytosolic arrival assay.

A monoclonal HeLa cell line, termed NG-SNAP, stably expressing the cytosolic mNeonGreen-SNAP-tag capture protein was generated for the assay. Diffuse mNeonGreen fluorescence and BG-fluorophore labeling were observed, which documented the expression of properly folded protein in the cytosol (Figure 1 b). To test whether the cytosolically localized mNeonGreen-SNAP-tag was fully functional, immunoprecipitation and pull-down experiments were performed against each of its two subunits: i) Lysates from NG-SNAP cells were incubated with an excess of BG–biotin, followed by streptavidin pull-down. This led to the complete depletion of mNeonGreen-SNAP-tag from the lysates, thereby proving that the SNAP-tag subunit was fully functional (Figure 1 c). ii) The same approach using anti-mNeonGreen nanobody beads also led to the depletion of mNeonGreen-SNAP-tag from the lysates, which further validated the functionality of the fusion protein (Figure 1 d). The combination of highly efficient SNAP-tag reaction and complete mNeonGreen immunoprecipitation laid the foundation for a fully quantitative assay.

Linearity and sensitivity are key parameters of a quantitative assay. To this end, low picomolar concentrations of BG- and biotin-tagged STxB were added to mNeonGreen-SNAP-tag-containing cell lysate, and incubated at 37 °C to allow for BG-SNAP-tag reaction. Subsequent mNeonGreen immunoprecipitation and ELISA development resulted in a linear standard curve, which documented the exquisite sensitivity of the assay (Figure 1 e).

Importantly, on cells, using a membrane-permeable BG-derivative, it was possible to quench non-reacted SNAP-tag prior to lysis (Figure 1 f). In the real assay format, this step is required to avoid post-lysis reaction between non-cytosolic BG-tagged vector and non-conjugated SNAP-tag in the lysate. Finally, STxB showed normal intracellular trafficking in NG-SNAP cells and in cells stably expressing mNeonGreen in the absence of SNAP-tag (termed NG cells), which were used as controls (Figure S2). All these findings qualified the engineered NG-SNAP and NG cell lines for the Cyto-SNAP assay.

The Cyto-SNAP assay (Figure S3) was first used to provide relative quantifications of cytosolic arrival between different conditions (incubation times, vector concentrations or inhibitor treatments). STxB (Figure 2 a,b) and TAT (Figure 2 g,h) translocation to the cytosol increased in a time- and concentration-dependent manner. For STxB, the translocation signal started to plateau at concentrations above 100 n m (Figure 2 b and S4a), while TAT translocation continued to increase exponentially beyond at least 20 μ m (Figure 2 h and S4b), suggesting that the process was receptor-independent for TAT, and receptor-dependent for STxB. Depletion of the STxB receptor, glycosphingolipid Gb3, by incubation of NG-SNAP cells with a glucosylceramide synthase inhibitor indeed reduced the cytosolic arrival of STxB to background level (Figure 2 c). Background was defined throughout all experiments as ELISA signal observed from NG cells. STxB translocation to the cytosol was also greatly impacted when incubations were performed at low temperatures, i.e., 4 °C or 19.5 °C (Figure 2 d). This observation was likely caused by changes in membrane organization leading to the disappearance of domain boundaries at which membranes are more permeable. 15, 16 In ATP depleted cells, STxB arrival in the cytosol was also strongly decreased (Figure 2 e). As for the 4 °C condition, endocytosis of STxB is inhibited in ATP-depleted cells. 17 Thus, it can be concluded that cellular entry is required for efficient translocation to the cytosol. The arrival of STxB in the cytosol was also found to be partially reduced when endosomal acidification was inhibited (Figure 2 f). Finally, TAT was compared to TAT-PEG6-GFWFG, previously reported to have an enhanced capacity to translocate to the cytosol. 18 We found no difference in cytosolic arrival at concentrations below 10 μ m (Figure 2 i). In contrast, TAT-PEG6-GFWFG translocated much more efficiently than TAT at concentrations above 15 μ m (Figure 2 i). TAT undergoes endocytosis at low concentrations, whereas at concentrations above 10 μ m direct translocation across the plasma membrane becomes the dominant mechanism (ref. 19 for a review, see ref. 20 ). It therefore appears likely that the strongly enhanced cytosolic arrival of TAT-PEG6-GFWFG at concentrations above 15 μ m resulted from direct translocation across the plasma membrane. These results qualified the Cyto-SNAP assay for membrane translocation measurements with different types of vectors.

Relative quantifications of STxB and TAT translocation to the cytosol, using the Cyto-SNAP assay on NG-SNAP cells. In all experiments, NG cells served as background controls. The cytosolic signal is expressed as percentage of the maximum signal obtained in each individual replicate experiment. a) Time dependency. Cells were incubated with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A for 0, 4, or 24 h (continuous incubation). The cytosolic signal increased with time. b) Concentration dependency. Cells were incubated for 4 h with STxB-BG-biotin conjugate A at the indicated concentrations. The cytosolic signal increased with concentration. c) Glycosphingolipid dependency. Cells were pre-treated or not for 5 days with the glycosylceramide synthase inhibitor Genz-123346, and then incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A. The translocation process to the cytosol was glycosphingolipid dependent. d) Temperature dependency. Cells were incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A at the indicated temperatures. Translocation to the cytosol was blocked at 4 °C and 19.5 °C. e) ATP dependency. Cells were incubated for 90 min with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A under ATP depletion conditions. Translocation to the cytosol was ATP dependent. f) Acidification dependency. Cells were incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A in the presence or absence of 100 n m of the V-ATPase inhibitor bafilomycin A1. Translocation to the cytosol was partly inhibited by bafilomycin A1 treatment. g) Time dependency of TAT translocation to the cytosol. Cells were incubated with 200 n m BG-biotin-TAT conjugate C for 0, 4, or 24 h (continuous incubation). The cytosolic signal increased with time. h) Concentration dependency of TAT translocation to the cytosol. Cells were incubated for 4 h with BG-biotin-TAT conjugate C at the indicated concentrations. The cytosolic signal increased with concentration. i) Comparison of TAT versus TAT-PEG6-GFWFG. NG-SNAP cells were incubated for 4 h at 37 °C with different concentrations of TAT or TAT-PEG6-GFWFG. Cytosolic signal is normalized to signal from 25 μ m TAT. TAT-PEG6-GFWFG has an increased cytosolic translocation capacity compared to TAT at concentrations above 15 μ m . Statistical analysis: two-tailed paired t-test * p<0.05 ** p<0.01 and *** p<0.001.

For absolute quantification of cytosolic arrival, the conjugation of BG and biotin reporter moieties was optimized in order to achieve 1:1 molar ratios of both BG and biotin per vector (or per monomer in the case of homopentameric STxB). We synthesized several scaffolds, comprising each BG, biotin, and maleimide for conjugation to the vectors (Scheme 1 and Figure S5–7). All STxB-based conjugates showed intracellular retrograde trafficking to the Golgi, as for non-modified STxB (Figure S8). With increasing PEG linker sizes, STxB conjugates C and D showed higher ELISA signal intensity when added directly in cell lysate (Figure 3 a). This was likely due to reduced steric hindrance for streptavidin binding to biotin on STxB pentamer whose BG had already reacted with the SNAP-tag. The same effect was not observed on the monomeric TAT (Figure 3 b). In contrast, cytosolic arrival was reduced for both STxB and TAT with the increased PEG linker size of scaffold D (Figure 3 c,d). An effect of long PEG linkers on cytosolic arrival was previously reported for the cell-penetrating peptide TAT-PEG-GWWG: PEG12 or PEG18 diminished the translocation efficiency when compared to PEG6. 18 In order to balance sensitivity and translocation efficiency, we chose to work with the maleimide-BG-biotin scaffold C. The resulting STxB conjugate C had a membrane translocation capacity similar to conjugate A, for which BG and biotin were separately coupled to STxB.

Evaluation of the different STxB and TAT conjugates for the Cyto-SNAP assay. a,b) Comparison of the ELISA signal obtained with the different STxB and TAT conjugates directly added into cell lysate. 40 p m of each STxB conjugate or 100 p m of each TAT conjugate were added to NG-SNAP cell lysate and incubated for 1 h at 37 °C for the SNAP reaction to occur before mNeonGreen immunoprecipitation and ELISA development on beads. c,d) Comparison of cytosolic arrival signal from the different STxB conjugates (40 n m ) or TAT conjugates (200 n m ) after 4 h incubation at 37 °C with NG or NG-SNAP HeLa cells.

Different strategies used for biotin and BG conjugation to vectors a) Biconjugation method: Use of commercial NHS ester—BG for conjugation to amines of the vector, and maleimide-biotin for conjugation to thiol. b–d) Monoconjugation method: Synthesized maleimide-benzylguanine-biotin molecules for conjugation to thiol of the vector. Different PEG linker sizes were tested in order to avoid steric hindrance between vector, the BG reaction with the SNAP-tag, and streptavidin binding to the biotin moiety.

The choice of lysis conditions was also critical for quantification to ensure that vectors are extracted from membranes with which they may remain associated even after translocation to the cytosolic compartment (see ref. 14 for STxB). We used high salt concentrations and sonication as recommended for TAT extraction, 21 and optimized the choice of detergent to achieve complete STxB extraction (Figure S9a). These conditions remained fully compatible with the requirement for SNAP-tag reaction and immunoprecipitation (Figure S9b,c).

For absolute quantification, a standard curve is essential. For this, we have devised a simple approach (Figure S10): Known amounts of BG and biotin-tagged vector were mixed into NG-SNAP cell lysate, leading to complete reaction with the SNAP-tag protein of the lysate. As shown in Figure 1 e, low picomolar sensitivity was reached with this approach. Using the standard curve, the amount of vector translocated to the cytosol and the total amount of vector associated with NG-SNAP cells were then determined (Figure S10). For the total cell-associated amount, the SNAP-tag quenching step was omitted, such that BG and biotin-tagged vector molecules fully reacted with unquenched SNAP-tag in the cell lysate. Of note, immunoprecipitation and subsequent ELISA steps were performed for all samples in parallel under identical conditions such that absorbance readings could be compared directly.


Bacterial Conjugation Steps

In order to transfer the F-plasmid, a donor cell and a recipient cell must first establish contact. At this point, when the cells establish contact, the F-plasmid in the donor cell is a double-stranded DNA molecule that forms a circular structure. The following steps allow the transfer of the F-plasmid from one bacterial cell to another:

Étape 1

The F + (donor) cell produces the pilus, which is a structure that projects out of the cell and begins contact with an F – (recipient) cell.

Étape 2

The pilus enables direct contact between the donor and the recipient cells.

Étape 3

Because the F-plasmid consists of a double-stranded DNA molecule forming a circular structure, i.e., it is attached on both ends, an enzyme (relaxase, or relaxosome when it forms a complex with other proteins) nicks one of the two DNA strands of the F-plasmid and this strand (also called T-strand) is transferred to the recipient cell.

Étape 4


Voir la vidéo: Chapitre 6 - 1ère Partie: Le système endocrinien - Cours de Biologie du DAEU-B (Janvier 2022).