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Quel est le moyen le plus rapide de créer une bibliothèque de numérisation d'alanine ?

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Pour les études interfaciales, je voudrais construire une bibliothèque de balayage d'alanine pour l'une de mes protéines en examinant 20 sites. Je finirai par exprimer le gène en utilisant E. coli synthèse de protéines acellulaires. J'ai déjà le gène modèle qui a été construit à l'origine à l'aide d'un assemblage PCR. Maintenant, quelle est la meilleure façon de créer une bibliothèque de numérisation ?


Le plus rapide changera au fur et à mesure que le temps passera et que de meilleures technologies seront développées.

Je pense que la méthode la plus rapide qui existe actuellement est Shotgun Mutagenesis (fournie par Integral Molecular Inc).

Cela n'emploie aucune nouvelle méthode pour le faire. Ils fournissent juste un ensemble de plasmides, qui a toutes les mutations possibles. L'ensemble lui-même est généré par synthèse d'ADN automatisée.

Donc, si vous n'avez pas de synthétiseur d'ADN avec vous, commandez simplement le kit auprès de l'entreprise.


Frontières en chimie

Les affiliations de l'éditeur et des réviseurs sont les dernières fournies sur leurs profils de recherche Loop et peuvent ne pas refléter leur situation au moment de la révision.


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    Synthèse et livraison de bibliothèques personnalisées

    Pepscan propose des puces peptidiques personnalisées dans toutes les tailles et tous les formats, allant d'un petit ensemble de peptides à des bibliothèques de milliers d'espèces différentes. Les longueurs de peptide varient généralement de 5 à 30 acides aminés, ce qui est suffisant pour la plupart des applications. Cependant, en tant qu'inventeur du concept de bibliothèque de peptides, Pepscan fournit également des bibliothèques de peptides d'une longueur maximale de 50 acides aminés, si nécessaire avec des contraintes de conformation ou des modifications post-traductionnelles. Les bibliothèques de peptides sont fabriquées sur la plate-forme de synthèse de peptides de pointe de Pepscan, généralement à une échelle de 4 moles. Cela donne généralement 1 à 4 mg de peptide brut, idéal pour un travail de criblage rapide et efficace. Un CQ supplémentaire est disponible sur demande. En règle générale, la synthèse commence dans les jours suivant la passation de la commande, avec des délais de livraison standard d'environ 3 à 4 semaines, en fonction de la taille de la bibliothèque et de la longueur du peptide. Les bibliothèques de peptides personnalisées sont livrées sous forme de peptides lyophilisés dans des plaques à 96 puits pour un criblage à haut débit ou dans des microtubes individuels. Tous les peptides de la bibliothèque seront livrés sous forme de sels de TFA sous forme de poudres lyophilisées.

    Sur demande, nous produisons des bibliothèques de peptides avec différentes modifications structurelles, telles que l'acétylation N-terminale, la biotinylation, la phosphorylation Ser/Thr, la N-méthylation ou le marquage avec des colorants fluorescents. Veuillez nous contacter pour plus d'informations sur les modifications personnalisées.


    2. Matériels et méthodes

    L'application Web présente une interface utilisateur simple ( Fig. 1) qui englobe les fonctionnalités de l'application en ligne de commande BudeAlaScan, qui est décrite et comparée en détail ailleurs ( Ibarra et al., 2019). En bref, l'application en ligne de commande BudeAlaScan utilise ISAMBARD ( Wood et al., 2017) pour préparer les fichiers d'entrée pour une version personnalisée du Bristol University Docking Engine (BUDE) ( McIntosh-Smith et al., 2012), qui effectue CASM en utilisant un champ de force empirique d'énergie libre pour estimer l'énergie libre de liaison. La précision de BudeAlaScan a été testée expérimentalement et se compare favorablement à d'autres méthodes ( Ibarra et al., 2019), mais est nettement plus rapide que les alternatives, ce qui le rend idéal pour une utilisation dans une application Web interactive.

    Présentation de l'application web BAlaS. (UNE) L'interface principale contient un visualiseur de structure et un panneau pour soumettre des travaux et afficher les résultats. Le panneau de scan est visible à droite et affiche les résultats d'un travail CASM, avec un tableau décrivant la contribution énergétique de chaque résidu. (B) L'onglet constellation affiche les énergies calculées pour chaque constellation, en l'occurrence à partir d'un job en mode résidus. (C) Le panneau des travaux affiche tous les travaux qui ont été soumis par l'utilisateur. L'utilisateur peut afficher les résultats, créer un lien vers le travail qu'il peut partager, télécharger la sortie complète ou supprimer le travail.

    Présentation de l'application web BAlaS. (UNE) L'interface principale contient un visualiseur de structure et un panneau pour soumettre des travaux et afficher les résultats. Le panneau de scan est visible à droite et affiche les résultats d'un travail CASM, avec un tableau décrivant la contribution énergétique de chaque résidu. (B) L'onglet constellation affiche les énergies calculées pour chaque constellation, en l'occurrence à partir d'un job en mode résidus. (C) Le panneau des travaux affiche tous les travaux qui ont été soumis par l'utilisateur. L'utilisateur peut afficher les résultats, créer un lien vers le travail qu'il peut partager, télécharger la sortie complète ou supprimer le travail.

    Le front-end de l'application BAlaS est écrit en Elm (https://elm-lang.org/) et gère la validation des entrées, la gestion des tâches et la visualisation des résultats. Les structures sont affichées à l'aide de la bibliothèque PV JavaScript ( Biasini, 2015). L'architecture backend est relativement simple : NGINX est utilisé pour servir l'application et les fichiers de résultats une base de données NoSQL (MongoDB) est utilisée pour la file d'attente des travaux et pour stocker les résultats un simple script interroge la base de données et exécute les travaux BudeAlaScan et une API RESTful, écrite utilisant la bibliothèque Flask Python (http://flask.pocoo.org/), est utilisé par le front-end pour soumettre des travaux et récupérer des résultats. L'ensemble de la pile d'applications s'exécute dans trois conteneurs Docker (https://www.docker.com/), ce qui permet aux utilisateurs d'exécuter l'application Web localement s'ils le souhaitent.

    Le mode constellation permet à l'utilisateur de combiner plusieurs mutations de l'alanine pour trouver des régions du « ligand » qui interagissent en coopération avec le « récepteur », que nous appelons constellations chaudes, c'est-à-dire que le G lorsque tous les résidus sont simultanément mutés en alanine, est supérieur à la somme des valeurs de ΔΔG lorsque chaque résidu est muté en alanine individuellement. Ceci est utile pour mettre en évidence les régions du « ligand » qui sont essentielles à la formation de l'interaction avec le « récepteur ». Les tâches Constellation peuvent être exécutées dans l'un des trois modes suivants : manuel, résidus et automatique. En mode manuel, l'utilisateur précise tous les résidus d'une constellation. En mode résidus, l'utilisateur sélectionne une liste de résidus et une taille de constellation, et toutes les permutations des résidus égales à la taille de la constellation sont évaluées. En mode auto, l'utilisateur définit une taille de constellation, un seuil ΔΔG (kJ/mol) et un seuil de distance Cα-Cα (Å). Des permutations de tous les résidus avec un G au-dessus de la coupure sont créées pour la taille de constellation définie, à condition que les résidus se trouvent dans la distance de coupure Cα-Cα les uns des autres.

    Enfin, l'onglet tâches est utilisé pour gérer les tâches de l'utilisateur ainsi que pour récupérer et partager les résultats. Les résultats complets de l'application en ligne de commande peuvent être téléchargés sous forme de fichier zip et contiennent les données ΔΔG au format texte, ainsi que des scripts pour afficher les résultats dans le programme de graphiques moléculaires Chimera. Les utilisateurs peuvent tracer facilement les données graphiques (fichiers json) contenues dans la sortie via le script replotAlaScan.py dans le package BudeAlaScan.


    Les références

    Littlewood, T. et Evan, G. I. Facteurs de transcription hélice-boucle-hélice (Oxford Univ. Press, New York, 1998).

    Winston, R.L. et amp Gottesfeld, J.M. Chem. Biol. 7, 245–251 (2000).

    Murre, C., McCaw, P.S. et Baltimore, D. Cellule 56, 777– 783 (1989).

    Ferre-D'Amare, A.R., Prendergast, G.C., Ziff, E.B. & Burley, S.K. La nature 363, 38–45 ( 1993).

    Ma, P.C., Rould, M.A., Weintraub, H. & Pabo, C.O. Cellule 77, 451–459 ( 1994).

    Grandori, C. et Eisenman, R. N. Tendances Biochem. Sci. 22, 177–181 (1997).

    Grandori, C., Mac, J., Siebelt, F., Ayer, D.E. & Eisenman, R.N. EMBO J. 15, 4344– 4357 (1996).


    Matériaux et méthodes

    Construction de la souche

    Les souches originales d'allèles de balayage d'actine alanine ont été construites avec à la fois un HIS3 marqueur et un lié baignoire2-201 allèle du gène β-tubuline qui confère une résistance au bénomyl (Wertman et Drubin 1992). Nous craignions que la mutation β-tubuline ne contribue aux interactions génétiques dans nos cribles. De plus, dans notre procédure CHI, nous préférons que les allèles mutants soient marqués avec un gène de résistance à la nourseothricine (NAT r ) lié car cela donne une sélection très étroite. Par conséquent, nous avons entrepris de reconstruire les allèles de balayage d'actine alanine dans un contexte plus approprié. Au cours de ce processus, nous avons découvert que sept des mutants originaux de l'analyse de l'actine alanine présentaient des mutations supplémentaires. Nous avons corrigé les sept, mais avons constaté que deux mutants précédemment signalés comme étant des allèles létaux récessifs étaient en fait probablement des allèles létaux dominants et ne pouvaient donc pas être utilisés dans notre analyse. La correction de ces sept allèles et leur analyse phénotypique est décrite dans une lettre à La génétique (Viggiano et al. 2010). Cela a laissé 31 allèles de balayage d'alanine, marqués avec NAT r et sans la mutation β-tubuline pour l'analyse CHI. De plus, nous avons inclus les acte1-159 allèle qui code pour un mutant d'actine stabilisant les filaments (Belmont et Drubin 1998). Le tableau 1 répertorie ces allèles, leurs phénotypes, leurs emplacements et le nombre d'interactions.

    Tableau 1

    allèleMutationPhénotypeEmplacementInteractions CHI
    acte1-101D363A,E364ATs − , récessifCôté13
    acte1-102K359A, E361AType sauvageCôté16
    acte1-103E334A,R335A,K336AMortel, récessifDevant26
    acte1-104K315A, E316AType sauvageCôté18
    acte1-105E311A,R312ACs − , Ts − , récessifDevant113
    acte1-106R290A, K291A, E292AMortel, récessifCôté41
    acte1-107D286A,D288AMortelle, dominante partielleHaut/bas50
    acte1-108R256A, E259ATs − , faiblement dominantArrière63
    acte1-109E253A, R254AMortelle, dominante partielleDevant52
    acte1-110E237A, K238AMortelle, dominante partielleHaut/bas45
    acte1-111D222A,E224A,E226ATs − , récessifCôté57
    acte1-112K213A,E214A,K215ACs − , Ts − , récessifDevant100
    acte1-113R210A, D211ATs faible −, récessifDevant21
    acte1-115E195A, R196AType sauvageHaut/bas11
    acte1-116D187A, K191AType sauvageArrière5
    acte1-117R183A,D184AType sauvageArrière4
    acte1-119R116A,E117A,K118ATs − , récessifArrière12
    acte1-120E99A, E100ATs − , récessifCôté7
    acte1-121E83A, K84ACs − , Ts − , récessifCôté7
    acte1-122D80A, D81ACs − , Ts − , récessifCôté9
    acte1-123R68A, E72AType sauvageArrière33
    acte1-124D56A, E57ATs − , récessifDevant11
    acte1-125K50A, D51ACs − , Ts − , récessifCôté3
    acte1-127E270A,D275AMortel, récessifArrière19
    acte1-128E241A,D244AMortelle, dominante partielleHaut/bas40
    acte1-129R177A,D179ATs − , récessifArrière10
    acte1-131K61A,R62AMortelle, dominante partielleHaut/bas54
    acte1-132R37A, R39ACs − , Ts − , récessifArrière34
    acte1-133D24A,D25ACs − , Ts − , récessifDevant34
    acte1-135E4AType sauvageDevant9
    acte1-136D2AType sauvageND14
    acte1-159V159NTs − , récessifFente ATP17

    CHI, haplo-insuffisance complexe ND, non déterminé.

    La plupart acte 1 des souches mutantes de scan alanine ont été générées comme décrit précédemment (Haarer et al. 2007). Les souches portant le acte1-107, -108, -127, -128, et -136 allèles ont été générés en transformant les diploïdes hétérozygotes correspondants précédemment décrits (Viggiano et al. 2010) avec le CEN URA3ACT1 plasmide pKFW29, suivi d'une dissection tétrade pour générer les souches utilisées dans les cribles d'hétérozygotie complexes.

    Les acte1-159 souche a été générée en croisant la souche DAY245 (MATa leu2his3ura3act1-159:Nat R tub2-201 lyp1can1 utilisé pour l'analyse SGA) à BY4741 un acte1-159:Nat R segregant a été rétrocroisé avec BY4741 et un haploïde acte1-159: Nat R le ségrégeant de ce diploïde a été transformé avec pKFW29 et utilisé dans les cribles d'hétérozygotie complexes. Contrairement à l'autre acte 1 souches, cette souche porte le acte 1-lié baignoire2-201 mutation.

    Écrans d'hétérozygotie complexes entre acte 1 allèles de balayage d'alanine et le acte 1∆ Ensemble de gènes CHI

    Les criblages d'hétérozygotie complexes décrits dans cette étude ont été effectués comme décrit précédemment (Haarer et al. 2007). En résumé, les souches haploïdes portant un mutant marqué Nat R acte 1 allèles et contenant également ACTE 1 sur un CEN URA3 plasmide (pKFW29) ont été accouplés à des souches supprimées (par le marqueur kan R/G418 R) pour les gènes précédemment montrés pour afficher une haploinsuffisance complexe avec acte1∆ (Haarer et al. 2007) et nos résultats non publiés). Les diploïdes ont été sélectionnés sur des milieux contenant du G418 et de la nourséothricine, suivis d'une série de colonies diploïdes individuelles sur des milieux appariés contenant du G418 et du Nat avec ou sans FOA, qui contre-sélectionnent contre les cellules qui portent le URA3 marqueur de pKFW29. Les stries sur les milieux FOA +/− ont été incubées à 34,5° et 37° pour la plupart des croisements, ou à 25° et 30° pour les souches qui présentent une sensibilité à la température en raison de l'haploinsuffisance de la délétion du gène particulier testée . Le score des défauts de croissance est le suivant : un score de 1 est la létalité, un score de 2 correspond à des défauts de croissance sévères tels que reflétés par de petites colonies par rapport aux hétérozygotes témoins, et un score de 3 reflète des tailles de colonies qui sont sensiblement plus petites que les hétérozygotes témoins.

    Analyse de corrélation de caractéristiques de degré d'interaction

    La collection de caractéristiques physiologiques et évolutives de l'ensemble de gènes CHI a été tirée directement de (Costanzo et al. 2010). La corrélation de Pearson a été utilisée pour mesurer la corrélation entre le degré du gène CHI et chaque caractéristique à l'aide de MATLAB.

    Analyse de cluster des interactions hétérozygotes complexes avec les allèles d'actine

    Les profils d'interaction des mutants d'actine ont été regroupés en utilisant Cluster 3.0 (de Hoon et al. 2004). Nous avons effectué un regroupement hiérarchique pour les allèles et les gènes de la matrice. La similarité a été mesurée en utilisant une corrélation de Pearson non centrée avec un couplage moyen. L'algorithme de clustering nécessitait d'inverser le poids des scores : nous avons défini 3 comme le score le plus fort et 1 comme le score le plus faible afin que les scores faibles soient les plus proches des non-interactions.

    Modélisation moléculaire

    Les modèles moléculaires ont été créés en utilisant UCSF Chimera (Pettersen et al. 2004) et Adobe Photoshop.

    Microscopie à fluorescence

    Le plasmide exprimant Sec4-GFP pRC556 (don d'Anthony Bretscher) (Schott et al. 2002) a été transformée en souche haploïde sauvage BY4741, acte1-112 souche haploïde SVY413, et act1-112/ACT1 poids souche SVY331. Les cellules ont été cultivées jusqu'à

    2 × 10 7 cellules/mL, repérées sur des coussins de gélatine à 25 % dans un milieu synthétique complet sur des lames de verre, et des images statiques et en accéléré ont été capturées sur un microscope à épifluorescence Zeiss Imager.Z1 avec un objectif Apochromator Plan 100X (huile , ouverture numérique de 1,46) à l'aide d'une caméra Orca ER (Hamamatsu Photonics). Les images ont été traitées avec le logiciel Zeiss AxioVision et Adobe Photoshop.


    Résumé

    Le palivizumab a été le premier anticorps monoclonal antiviral (mAb) approuvé pour une utilisation thérapeutique chez l'homme, et reste un traitement prophylactique pour les nourrissons à risque de maladie grave en raison du virus respiratoire syncytial (VRS). Le palivizumab est une version humanisée modifiée d'un mAb murin ciblant le site antigénique II de la protéine de fusion (F) du RSV, une cible clé dans le développement de vaccins. Il existe peu d'AcM humains naturels rapportés au site II, par conséquent, la base structurelle de la reconnaissance par les anticorps humains de ce site antigénique majeur est mal comprise. Ici, nous décrivons une classe non neutralisante d'AcM spécifiques au site II qui étaient en compétition pour la liaison avec le palivizumab à la protéine F du VRS postfusion. Nous décrivons également deux classes d'AcM neutralisants spécifiques au site II, dont l'une a échappé à la compétition avec les AcM non neutralisants. Une structure cristalline aux rayons X du mAb neutralisant 14N4 en complexe avec la protéine F a montré que l'angle de liaison auquel les mAb neutralisants humains interagissent avec le site antigénique II détermine si les anticorps non neutralisants entrent en compétition avec leur liaison. Des études de cartographie fine ont déterminé que les mAb non neutralisants qui interfèrent avec la liaison des mAb neutralisants reconnaissent le site II avec une pose qui facilite la liaison à un épitope contenant des résidus de surface F sur un protomère voisin. Les anticorps neutralisants, comme le motavizumab et un nouveau mAb désigné 3J20 qui échappent aux interférences des mAb inhibiteurs, évitent un tel contact en se liant à un angle qui s'éloigne du site non neutralisant. De plus, la liaison à des vaccins hélice-boucle-hélice épitope-échafaudage du site II conçus de manière rationnelle et informatique distingue les anticorps neutralisants des anticorps non neutralisants du site II.

    Le virus respiratoire syncytial (VRS) est un agent pathogène humain hautement contagieux, infectant la majorité des nourrissons avant l'âge de 2 ans, et est la principale cause de bronchiolite virale et de pneumonie virale chez les nourrissons et les enfants (1, 2). Le VRS reste une priorité absolue pour le développement de vaccins, car des milliers de décès sont enregistrés dans le monde chaque année en raison de complications liées à une infection (3). À ce jour, il n'existe aucun vaccin homologué contre le VRS. Un objectif majeur du développement d'un vaccin contre le VRS a été l'inclusion de la protéine de fusion (F) du VRS, une glycoprotéine de fusion de classe I qui est synthétisée en tant que précurseur et clivée en deux fragments à liaison disulfure lors de la maturation en un trimère (4). Bien que le virion RSV contienne deux protéines de surface supplémentaires, la protéine de fixation (G) hautement glycosylée et la petite protéine hydrophobe, la protéine F est hautement conservée parmi les souches de souches de RSV et est la cible principale des anticorps neutralisants protecteurs.

    La protéine F est connue pour adopter au moins deux conformations majeures : la conformation préfusion métastable et la conformation postfusion. Après la fixation du virion à une cellule par la protéine G, la protéine F subit un réarrangement structurel spectaculaire, entraînant la fusion des membranes virale et cellulaire et, dans les cellules cultivées, provoque la formation de syncytia cellulaires. Quatre régions antigéniques neutralisantes majeures ont été identifiées à ce jour dans la protéine F, généralement désignées sites antigéniques I, II, IV et Ø, ces derniers n'étant présents que dans la conformation de préfusion. Le site II est la cible du palivizumab (5), un traitement prophylactique autorisé pour une utilisation chez les nourrissons à haut risque pendant la saison du VRS. Un candidat vaccin à sous-unité de protéine F du VRS comprenant des agrégats de la conformation postfusion du VRS F est actuellement testé dans des essais cliniques (6), et la compétition des anticorps sériques avec le palivizumab a été proposée comme corrélat sérologique potentiel de l'immunité pour ce vaccin (7, 8 ). Nous et d'autres avons isolé et étudié des mAb spécifiques au RSV à l'aide d'hybridomes murins (9), de cellules B de macaques triées (10) et de cellules B humaines transformées ou de bibliothèques de phage display de gènes d'anticorps humains (11, 12). Les exemples incluent les mAb 101F (9), D25 (13) et le motavizumab du site II de nouvelle génération mAb motavizumab (14). Cependant, aucun mAb humain naturel n'a été signalé au site II, et le palivizumab est une version humanisée modifiée du mAb murin 1129 (15). Par conséquent, le répertoire des anticorps humains interagissant avec le site II et la base structurelle de leur reconnaissance de ce site antigénique majeur est mal compris.

    Pour caractériser la réponse immunitaire humaine à la protéine RSV F, nous avons isolé et caractérisé des mAb humains ciblant la protéine RSV F, et en particulier concentré les efforts de découverte sur le site antigénique II. La définition de la base structurelle pour l'interaction des anticorps spécifiques du site II a révélé de nouvelles informations sur la complexité de ce site et divers modes de reconnaissance qui ont déterminé si les anticorps humains concurrents du site II neutralisaient ou non le RSV.


    Résumé de la mutagenèse dirigée

    En bref, des mutations ponctuelles peuvent être introduites dans des plasmides à l'aide d'amorces (avec la mutation souhaitée) dans un protocole PCR qui amplifie la totalité de la matrice plasmidique. La matrice parente est retirée à l'aide d'une endonucléase dépendante de la méthylation (c'est-à-dire DpnI), et les bactéries sont transformées avec le plasmide entaillé résistant à la nucléase (le produit PCR). Les plasmides sont isolés des colonies résultantes et criblés pour la modification souhaitée. Enfin, les clones positifs sont séquencés pour confirmer la modification souhaitée et l'absence de modifications supplémentaires.


    Service de synthèse de bibliothèque de peptides Omizzur :

    Une large gamme d'outils de conception de bibliothèques : chevauchement, tronqué, cellules T tronquées, scan Alanine, bibliothèque aléatoire, brouillé, scan positionnel, scan conbinatoire 2/3 positions pour répondre à différentes demandes.

    Éviter la contamination croisée

    Les peptides sont lyophilisés dans 96 tubes-plaques ou flacons individuels pour éviter toute contamination croisée.

    Modifications globales des peptides

    Omizzur intègre toutes les modifications peptidiques: modification des terminaux N/C, acides aminés spéciaux, conjugués peptidiques, biotine, marquage par fluorescence de phosphorylation, etc.

    Système de contrôle de qualité rigoureux

    La bibliothèque de peptides personnalisée suit le système de qualité Omizzur strict. Grâce à la plate-forme de synthèse automatique OMIZZU TM, Omizzur garantit une pureté élevée, aucune différence de lot pour chaque produit peptidique.

    Bibliothèque de peptidesBrut IJe purifiéPurifié II
    Longueur5-30AA5-15AA16-30AA
    PuretéBrut>70 %>98%
    Quantité3-20mg3-9mg3-9mg
    Livrer7-15 jours10-15 jours15-20 jours
    Commande minimum24 peptides24 peptides24 peptides
    Modifications peptidiquesModification des terminaux N/C, acides aminés spéciaux, conjugués peptidiques, biotine, phosphorylation, etc.
    bulletin d'analyseACOHPLC+COA+MSHPLC+COA+MS

    Applications Types de bibliothèquesSuggestion de pureté
    • Cartographie des épitopes de l'antigène.
    • Identification de l'épitope des lymphocytes T
    • Balayage de séquences de protéines
    Chevauchement de la bibliothèqueBrut
    • Immunothérapie des lymphocytes T
    • Étude du métabolisme des médicaments peptidiques
    Bibliothèque de troncatureBrut ou ≥70 %
    • Cartographie des épitopes d'anticorps
    • Étude de substrats enzymatiques
    Positionnement combinatoire
    Bibliothèque de numérisation
    Chevauchement de la bibliothèque
    Brut ou ≥70 %
    • Dosages biologiquesBibliothèque de peptides brouillés
    Chevauchement de la bibliothèque
    Jusqu'à 70%
    • Développement de vaccinsBibliothèque de numérisation AlanineJusqu'à 90%

    La bibliothèque de peptides est un mélange de fragments peptidiques d'une certaine longueur, qui contient toutes les informations d'arrangement possibles des acides aminés. Il existe deux types de bibliothèque de peptides, l'une est une bibliothèque de peptides synthétiques, l'autre est une bibliothèque de peptides de phage. la propriété de se lier à la protéine spécifique correspondante,Un seul fragment spécifique peut être sélectionné dans la bibliothèque de peptides en utilisant la protéine spécifique marquée,Les marqueurs utilisés pour marquer les protéines peuvent être des enzymes, de la fluorescéine, de la biotine, des isotopes, Nous appelons cela spécifique marqué protéine comme sonde.

    L'utilisation d'un anticorps monoclonal comme sonde peut cribler un fragment peptidique à haute affinité à partir de la bibliothèque de peptides synthétiques. Cette information d'épitope spécifique peut fournir une source d'inspiration importante pour le développement d'un vaccin peptidique. cellule réceptrice. Sur la base de ces informations, le scientifique peut développer des antagonistes peptidiques synthétiques spécifiques pour le récepteur des cytokines, qui peuvent être transformés en un médicament peptidique.

    Chevauchement de la bibliothèque de peptides

    Il est principalement utilisé pour la cartographie des épitopes de l'analyse des antigènes et des protéines. Par cette méthode, nous pouvons découvrir quel fragment d'acides aminés divisé à partir d'un peptide ou d'une protéine peut contribuer à l'activité biologique. La bibliothèque de chevauchement est principalement déterminée par deux paramètres clés : la longueur du peptide et l'offset nombre. La longueur du peptide est généralement de 5 à 15 AA et le nombre de numéros de décalage est généralement de 2 à 5.

    Les épitopes de cellules T sont généralement de courts peptides linéaires dans l'holoprotéine, de sorte que la bibliothèque de chevauchement est également une méthode courante pour cribler les épitopes de cellules T. La technologie de synthèse à haut débit AurPepTM offre la possibilité de ce travail de recherche.

    Domaine d'application : Cartographie d'épitope d'antigène, balayage d'holoprotéine, identification d'épitope de cellule T.

    Bibliothèque de peptides de troncature

    L'identification des séquences d'acides aminés les plus courtes liées à l'activité biologique, en éliminant systématiquement les acides aminés des deux côtés de la séquence peptidique d'origine, peut identifier la gamme minimale d'épitopes d'antigène.

    Domaine d'application : identification de la séquence bioactive la plus courte, métabolisme des médicaments peptidiques in vivo.

    L'alanine est le plus petit acide aminé chiral dans 20 types d'acides aminés naturels. Il peut être utilisé pour identifier l'effet de chaque site du peptide cible sur son activité biologique en remplaçant individuellement chaque acide aminé dans la séquence. Lorsque les résidus d'acides aminés essentiels sont remplacés par l'alanine, les peptides réduiront d'autant l'activité biologique.

    Domaine d'application : Étudiez l'effet d'un acide aminé spécifique sur l'ensemble de la fonction protéique.

    Il utilise 20 types d'acides aminés naturels pour remplacer les résidus d'acides aminés sélectionnés dans le peptide d'origine simultanément et de manière aléatoire par une approche fusil de chasse, afin de former autant de mutations aléatoires que possible. De cette manière, des peptides avec des fonctions ou des activités spécifiques peuvent être identifiés préalablement dans un groupe de séquences actives.

    Domaine d'application : séquence peptidique d'optimisation, découverte de médicaments

    Bibliothèque de peptides brouillés

    Il est principalement utilisé pour le criblage de peptides ou l'optimisation de séquences peptidiques ciblant en tant que protéine, anticorps ou ADN. La conception de cette bibliothèque est basée sur le remplacement interne de la séquence peptidique d'origine. C'est la bibliothèque de peptides la plus mutée, également un outil de criblage aléatoire pour trouver de nouvelles cibles.

    Domaine d'application : criblage peptidique, optimisation de la séquence peptidique

    La bibliothèque tronquée de cellules T permet une identification haute résolution des épitopes de cellules T à travers une protéine. Le peptide a été progressivement coupé des deux extrémités pour former une bibliothèque de peptides, puis la bibliothèque de peptides a été mélangée dans un pool de peptides pour cribler le meilleur épitope de cellule T. La bibliothèque de peptides tronqués de cellules T fournit une garantie puissante pour le criblage du meilleur épitope de cellule T d'intérêt.

    Domaine d'application : testez tous les épitopes de cellules T possibles dans les protéines

    Bibliothèque de peptides à balayage positionnel combinatoire

    La bibliothèque de balayage positionnel combinatoire est un outil important pour l'optimisation des séquences peptidiques. et constitue une mise à niveau du balayage positionnel. 2 positions ou plus à la fois (remplacez chaque site du peptide par des acides aminés non naturels/naturels, des acides aminés D, des acides aminés dérivés de Phe/Tyr, une phosphorylation/N-méthylation, etc.)

    Ce sera 20 × 20 = 400 peptides à produire dans le processus de balayage à 2 positions avec 20 types d'acides aminés naturels, le balayage à 3 positions serait de 8000 peptides au total. En raison de l'énorme travail de substitution d'acides aminés, notre auto La plate-forme de synthèse AuaPepTM développée peut vous aider à générer rapidement cette combinaison matricielle. Veuillez nous indiquer la séquence, le site à étudier, la pureté et la quantité, notre plateforme de synthèse vous aidera automatiquement à générer cette matrice.

    Domaine d'application : Amélioration de l'activité biologique des peptides.,Étude de l'activité des substrats enzymatiques.

    Omizzur a introduit un équipement de synthèse peptidique automatique à haut débit avec une plate-forme de synthèse OMIZZUTM développée indépendamment pour produire des produits peptidiques de niveau mg et multi-séquences afin de répondre à la demande des clients en matière de bibliothèque de peptides. Le logiciel d'Omizzur vous aidera automatiquement à créer une bibliothèque de peptides lorsque vous nous indiquerez la séquence, la pureté et les autres exigences connexes que vous souhaitez étudier, et les résultats vous seront renvoyés par e-mail avec le devis pour vos références.

    1.Smith G P. Affichage de surface et bibliothèques de peptides. Gène, 1993, 128.1-2

    2. Devlin JJ, Pangniban L C, Devlin P E. Bibliothèques de peptides aléatoires : une source de science des molécules de liaison aux protéines spécifiques, 1990, 249 : 404-406

    3. Scott JK, Smith G P. Recherche de ligands peptidiques avec une bibliothèque d'épitopes. Science, 1990, 249 : 386-390

    4.Houghten RA, Pinilla C, Blondeelle SE, et al, Génération et utilisation de bibliothèques combinatoires de peptides synthétiques pour la recherche fondamentale et la découverte de médicaments [J]. Nature, 1991, 354: 84-86

    5. Ohlmeyer MH, Swanson RN, Dillard LW, et al, Bibliothèques chimiques synthétiques complexes indexées avec des étiquettes moléculaires [J], Proc Natl Acad Sci, 1993, 90: 10922-10926


    Conclusion

    Le serveur Web ABS-Scan peut fournir des informations précieuses sur la reconnaissance moléculaire impliquant des interactions protéine-ligand. Les structures protéine-ligand déterminées expérimentalement peuvent être étudiées pour comprendre les contributions des résidus individuels à la liaison du ligand. Des complexes modélisés peuvent également être soumis pour déduire la faisabilité de l'interaction. Nous pensons que l'ABS-Scan ajouterait une dimension supplémentaire à l'analyse des sites de liaison dans les protéines, à la comparaison de diverses interactions de ligands et serait important pour les chercheurs effectuant des études ASM.


    Voir la vidéo: Kastelli-kodin valmistuminen (Février 2023).