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Comment observer un embryon de poisson zèbre en détail ?

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De combien de zoom de microscope aurais-je besoin pour observer le développement d'un embryon de poisson zèbre avec certains détails ? Merci les gars!


D'après l'expérience personnelle, il devrait être suffisant d'observer le poisson zèbre à un grossissement de 10 à 20 fois pour de larges changements structurels au cours du développement. Si votre microscope a un oculaire 10x, alors ce serait un zoom 1-2x. Si vous observez des changements sous-cellulaires, vous bénéficierez d'un grossissement plus élevé.


Poisson zèbre

Résumé

Le poisson zèbre est reconnu comme un organisme modèle idéal pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la formation et la régénération du cœur. Le poisson zèbre a un système cardiovasculaire fermé et un cycle cardiaque qui rappelle fortement la physiologie cardiovasculaire humaine. Le poisson zèbre peut être manipulé génétiquement et son génome a été entièrement séquencé. Des études génétiques chez le poisson zèbre ont découvert de nouveaux gènes et voies dans le développement et la fonction cardiovasculaire, avec une corrélation étroite avec les maladies cardiovasculaires. La régénération cardiaque du poisson zèbre se produit à la suite d'une blessure par dédifférenciation et prolifération de cardiomyocytes matures. Les criblages de petites molécules à base d'embryons ont découvert des sondes chimiques et des candidats médicaments pour améliorer le développement, la fonction et la régénération cardiovasculaires.


Le poisson zèbre, le miroir vivant

Au sous-sol du Pavillon des sciences de la vie, environ 1 500 aquariums, allant de la mallette à la petite caisse, sont systématiquement disposés en rangées sur des étagères métalliques. De l'œuf fécondé à l'adulte, les quelque 20 000 poissons représentent l'ensemble du cycle de vie du poisson zèbre, offrant à Bruce Draper une vue complète de leur croissance.

« Si vous examinez le processus de développement – ​​passer d'un œuf fécondé à un organisme nageant et nourrissant – tout ce processus chez les mammifères se déroule in utero, vous devez donc sacrifier la mère pour que les embryons soient étudiés. eux », dit Draper. "Avec le poisson zèbre, tout est une fertilisation externe."

Une partie de la recherche de Draper se concentre sur les problèmes de développement de la reproduction. Le poisson zèbre (Danio rerio) est bien adapté à cette recherche car ses embryons sont clairs, offrant une fenêtre sur la machinerie biologique derrière leur formation. En vieillissant, les poissons développent des rayures et perdent leur transparence.

Les chercheurs contournent ce problème en modifiant génétiquement le poisson zèbre avec une gonade, l'organe responsable de la production de spermatozoïdes et d'ovules, qui brille sous la lumière ultraviolette. Cela permet une surveillance continue du développement des gonades à mesure que le poisson grandit, fournissant des indices sur les maladies du développement de la reproduction comme le cancer de l'ovaire.

Auparavant, Draper et ses collègues ont identifié le gène fgf24 comme important pour le développement des gonades chez le poisson zèbre. Le poisson zèbre mutant a développé des gonades défectueuses et des capacités de reproduction limitées. Bien que cette signalisation génique spécifique ne soit pas connue pour être impliquée dans le développement des gonades des mammifères, de nombreux cancers de l'ovaire agressifs sont en corrélation avec une voie de signalisation hyperactive liée à ce gène. Dans l'ensemble, environ 84 pour cent des gènes associés aux maladies humaines ont des homologues chez le poisson zèbre.

Le professeur agrégé Bruce Draper utilise le poisson zèbre pour étudier le développement des gonades. Conçu par Steve Dana/UC Davis

Draper et ses collègues étudient comment le séquençage d'ARN unicellulaire pourrait aider à faire avancer leurs recherches. La technique permet une vue à haute résolution des cellules individuelles et des gènes qu'elles expriment.

"Nous identifions maintenant à un niveau beaucoup plus raffiné quels gènes sont exprimés dans des cellules particulières", dit-il, notant que les formes les plus agressives de cancer de l'ovaire se produisent généralement dans les parois cellulaires de l'organe. "Nous sommes très intéressés à essayer d'identifier ces cellules épithéliales dans notre ensemble de données afin que nous puissions commencer à demander quels autres gènes y sont exprimés."

Les techniques de Draper pour ce projet sont informées par Celina Juliano, dont le bureau se trouve à quelques portes du sien.


Le poisson zèbre aide à débloquer des indices sur les maladies humaines

Mai 2018—Du sol au plafond, rangée après rangée de petits réservoirs bouillonnants, 30 000 minuscules poissons tropicaux percèrent les secrets de maladies qui ont contrarié des générations de chercheurs et de médecins.

L'humble poisson zèbre, un membre d'eau douce d'un pouce et demi de long de la famille des ménés, est originaire des ruisseaux, des étangs et des flaques d'eau de la région himalayenne. Il ne ressemble pas beaucoup à un zèbre, bien qu'il ait cinq rayures horizontales ornant de chaque côté.

L'une des choses les plus intéressantes à propos du poisson zèbre est que lorsqu'il perd quelque chose - un œil, une nageoire, une queue, même des types de cellules individuelles - il en développe un nouveau.

Parce que leur profil génétique est remarquablement similaire au nôtre, le poisson zèbre se trouve également dans le Miller Research Building sur le campus médical de l'Université Johns Hopkins, où il fournit aux scientifiques des indices génétiques sur les mystères médicaux. Les poissons ont aidé les chercheurs de Johns Hopkins à faire des percées importantes dans la régénération du tissu oculaire, la compréhension du cancer de la thyroïde et la compréhension des enchevêtrements d'ADN qui régulent l'activité cellulaire.

Le Center for Functional Investigation in Zebrafish - ou le centre FINZ - est un centre de recherche de l'Institut McKusick-Nathans de médecine génétique. Trente noyaux différents de départements de l'Université Johns Hopkins offrent plus de 500 services différents liés à la recherche. Les centres permettent aux enquêteurs de partager des ressources et une expertise précieuses, ce qui leur permet d'économiser du temps et de l'argent.

Le codirecteur du centre FINZ, Jeff Mumm, du Wilmer Eye Institute et du McKusick-Nathans Institute, a déclaré qu'en plus de trois chercheurs de Johns Hopkins qui y maintiennent actuellement des aquariums de poissons, le centre collabore avec d'autres scientifiques.

Moyennant des frais, FINZ propose de nombreux services génétiques à ses collègues de toute l'institution, notamment la modification du génome pour produire des poissons présentant des traits que les chercheurs souhaitent étudier. Par exemple, un chercheur souhaitant étudier le développement et le fonctionnement du foie peut demander au centre FINZ de produire des poissons zèbres au foie brillant. Prenant un gène de méduse qui permet leur lueur incandescente, l'équipe FINZ introduit ce gène dans un poisson zèbre, éclairant le foie et permettant aux chercheurs d'observer sa croissance et sa fonction.

"C'est le genre de travail que nous faisons tout le temps", dit Mumm. "C'est un processus bon marché et efficace de travailler avec nous pour créer un poisson zèbre génétiquement modifié pour des besoins de recherche spécifiques."

En 2004, le généticien Andy McCallion, avec d'anciens collègues Shannon Fisher et Steven Leach, a proposé que Johns Hopkins construise sa propre installation de poisson zèbre. McCallion, qui co-dirige le centre FINZ, et Fisher, maintenant membre du corps professoral de l'Université de Boston, ont convaincu les dirigeants de la faculté de médecine que le poisson zèbre offrirait un moyen plus efficace et moins coûteux de faire de la recherche génétique.

McCallion et son équipe de laboratoire approfondissent les codes génétiques qui contrôlent quand et où les gènes sont activés/désactivés, combinant des outils génomiques de pointe et une intelligence artificielle informatique pour trouver les anomalies qui peuvent influencer des maladies telles que la maladie de Parkinson. Il dit que, bien que ce travail reste ardu, au début de sa carrière, il était beaucoup plus difficile.

"Nous pouvions voir des séquences qui se distinguaient comme très similaires parmi différentes espèces, mais nous n'avions pas de moyen à grande échelle et à l'échelle du génome de tester nos hypothèses", se souvient McCallion. « Nous avions besoin d'un moyen de tester des centaines et des centaines de ces choses. Pour de nombreuses raisons, étudier le poisson nous donne cette capacité. »

En plus de leur similitude génétique avec les humains, les poissons zèbres ont d'autres attributs qui les rendent attrayants pour les scientifiques qui ont besoin de rechercher un grand nombre du même organisme. Les poissons se reproduisent et mûrissent rapidement, ils sont faciles à entretenir et leurs œufs sont fécondés en dehors de leur corps, permettant aux chercheurs de récolter des embryons nouvellement fécondés. Pour produire le caractère souhaité chez un poisson, ils peuvent introduire de nouveaux gènes ou supprimer des gènes des embryons récoltés. Et comme les embryons de poisson zèbre sont translucides, les scientifiques peuvent observer leur développement en temps réel, en observant des organes et des systèmes entiers se développer à partir de cellules souches.

Mumm dit que, alors que la science s'est concentrée sur les souris comme modèles pour étudier les maladies depuis la création de la première souris génétiquement modifiée en 1980, le poisson zèbre est également devenu ces dernières années une espèce modèle importante.

Recherche sur le poisson zèbre | Dans les coulisses de l'installation Johns Hopkins Zebrafish

Le poisson zèbre joue un rôle important dans la recherche à Johns Hopkins. Frazer Matthews et Hannah Edelman nous font visiter l'installation où 30 000 poissons aident les chercheurs à découvrir des indices sur les maladies.

Pendant de nombreuses années, les mouches des fruits ont été l'espèce de choix des chercheurs en génétique, partageant plus de 61 pour cent des gènes avec les humains. Et bien que les insectes jouent toujours un rôle important, des différences physiologiques clés rendent les poissons, en tant que congénères vertébrés, attrayants.

Alors que le poisson zèbre partage environ 71% du génome humain, dans certains cas clés, les gènes des poissons correspondent presque parfaitement aux humains. Selon une étude réalisée en 2013 par des chercheurs britanniques, 82 pour cent des gènes associés aux maladies et troubles humains ont un équivalent poisson zèbre.

Les souris et les humains sont une correspondance génétique plus étroite, à environ 85 pour cent. Mais Mumm dit: "Le poisson zèbre offre une nouvelle perspective, offrant des opportunités uniques au-delà de ce qui est possible chez les souris." Le Mumm Lab est spécialisé dans la « biologie à haut débit », où des équipements automatisés traitent un grand nombre d'échantillons pour permettre un criblage chimique et génétique à grande échelle.

Cette approche est difficile et coûteuse à appliquer aux souris et a donc été largement limitée aux travaux de culture cellulaire. Cependant, en raison de leur petite taille, le poisson zèbre est devenu une plate-forme modèle de maladie vivante pour la découverte de médicaments à haut débit. Le Mumm Lab a développé une approche de dépistage basée sur le poisson zèbre qui évalue les effets des médicaments plus rapidement que jamais, en traitant des dizaines de milliers de poissons par jour.

Parce que leurs gènes peuvent être modifiés à très peu de frais et en grand nombre, Mumm dit que le poisson zèbre permet également aux scientifiques de poursuivre des initiatives de recherche génétique à grande échelle, en interrogeant la fonction d'un plus grand nombre de gènes en moins de temps.

Le chirurgien de Johns Hopkins, Jason Prescott, entretient de nombreux réservoirs de poissons zèbres dans le centre FINZ. Trois jours par semaine, il opère des patients atteints d'un cancer de la thyroïde. Mais il dispose également d'un laboratoire de recherche visant, un jour, à inverser la progression de la maladie et à éliminer le recours à la chirurgie. Le poisson zèbre aide Prescott à mieux comprendre comment les mutations génétiques peuvent rendre cancéreuse une thyroïde saine.

« L'objectif est de me retirer du secteur de la chirurgie », dit-il.

Prescott et son équipe de laboratoire étudient le codage génétique défectueux chez les patients qui viennent le voir pour une chirurgie du cancer de la thyroïde. Lorsqu'ils isolent le gène défectueux d'un patient, ils introduisent un gène similaire chez le poisson zèbre. Ensuite, ils observent les poissons pour connaître les origines des cellules cancéreuses et comment elles se répliquent.

« Les poissons ont des glandes thyroïdes très similaires aux nôtres », explique Prescott. « Anatomiquement, ils sont à peu près au même endroit et remplissent une fonction similaire. Et parce qu'ils sont vivants, nous pouvons réellement voir la biologie en temps réel, comme cela se produit. "

Les poissons permettent également des tests rapides et efficaces de médicaments pour lutter contre les maladies.
« En contournant les techniques de dépistage plus primitives, nous pouvons économiser du temps et de l'argent en testant des médicaments sur des centaines de poissons à la fois », dit-il. Dans un exemple de la recherche de Prescott, des poissons individuels, génétiquement modifiés pour avoir une thyroïde cancéreuse, sont placés dans des plats d'eau peu profonds. Les poissons ont été conçus pour que leur thyroïde brille lorsqu'un médicament particulier provoque une réaction particulière. Les chercheurs introduisent divers composés médicamenteux dans l'eau et étudient les résultats.

Le poisson zèbre a joué un rôle clé dans la poursuite par Prescott de percées pharmaceutiques pour lutter contre le cancer de la thyroïde.

« L'étalon-or pour les essais précliniques de médicaments est de travailler avec un organisme vivant », dit-il. "Cela nous permet un environnement beaucoup plus réaliste que de travailler avec des cellules qui poussent sur une plaque."

La capacité d'autoréparation

L'étudiante en médecine Hannah Edelman en est à six ans d'études dans son M.D./Ph.D. programme de recherche sur la génétique humaine et le diabète pédiatrique. Elle passe de nombreuses heures au centre FINZ à étudier comment le poisson zèbre ne contracte jamais la maladie.

Dans le diabète de type 1, le système immunitaire du patient attaque et détruit les cellules du pancréas qui produisent l'insuline, l'hormone qui régule la glycémie. Alors que les humains ne peuvent pas régénérer ces cellules, le poisson zèbre le peut.

"Ils peuvent faire repousser les cellules bêta pancréatiques", dit-elle, se référant aux cellules qui stockent et libèrent l'insuline. «Je veux savoir ce qui est si spécial qui leur permet de faire cela. Nous essayons de trouver un moyen pour que les humains puissent régénérer ces cellules. Cela signifierait beaucoup dans le traitement du diabète de type 1. »

Dans le travail de Mumm étudiant les maladies oculaires dégénératives, il tire parti du fait que les humains et le poisson zèbre partagent un trait - un type de cellule spécifique qui peut redevenir une cellule souche - qui leur permet de produire de nouvelles cellules en réponse à une blessure ou une maladie dans le rétine. Ainsi, les deux espèces ont la capacité de produire de nouvelles cellules pour guérir l'œil.

« Quelque part au cours de leur sélection évolutive, le poisson zèbre a développé la capacité d'auto-réparation », explique Mumm.

La différence, dit Mumm, est que, alors que les nouvelles cellules conduisent à une toute nouvelle rétine chez un poisson zèbre, les humains n'ont pas cette chance. « Pour nous, les nouvelles cellules deviennent du tissu cicatriciel. En fait, cela fait plus de mal que de bien aux humains. En culture cellulaire, cependant, ces cellules souches rétiniennes humaines sensibles aux blessures ont la capacité de produire de nouveaux neurones.

Il espère qu'en apprenant comment les puissantes capacités de régénération du poisson zèbre sont contrôlées, nous pourrons exploiter les capacités de régénération dormantes chez les patients atteints de maladies oculaires dégénératives. Il dit que les poissons accélèrent le processus en aidant à éliminer les impasses scientifiques plus rapidement que jamais.

En combinant ces études avec les techniques de criblage à haut débit de son laboratoire, Mumm déclare : « Nous pouvons découvrir ce qui ne fonctionne pas à la première étape plutôt qu'à l'étape 52. Cela représente beaucoup de temps et d'argent économisé. »


Dynamique des progéniteurs des photorécepteurs dans la rétine de l'embryon de poisson zèbre et sa modulation par les cils primaires et la N-cadhérine

Fond Les photorécepteurs de la rétine neurale des vertébrés proviennent du neuroépithélium et, comme les autres neurones, doivent subir une translocation du corps cellulaire et des transitions de polarité pour acquérir leur morphologie fonctionnelle finale, qui comprend les caractéristiques des cellules neuronales et épithéliales.

Méthodes Nous avons analysé ce processus en détail sur des embryons de poisson zèbre en utilisant in vivo microscopie confocale et microscopie électronique. Les progéniteurs des photorécepteurs ont été marqués par l'expression transgénique de l'EGFP sous la régulation du promoteur spécifique des photorécepteurs crx, et les gènes d'intérêt ont été renversés à l'aide d'oligomères morpholino.

Résultats Les progéniteurs des photorécepteurs se sont détachés de la rétine basale aux stades pré-mitotiques, rétractant rapidement un court processus basal lors de la translocation apicale du corps cellulaire. Ils sont restés indéfiniment en position apicale pour former la couche nucléaire externe (ONL), étendant et rétractant initialement des processus de type neurite hautement dynamiques, tangentiels à la surface apicale. De nombreux progéniteurs des photorécepteurs présentaient un court cil primaire apical. Le nombre et la longueur de ces cils ont été progressivement réduits jusqu'à presque disparaître autour de 60 hpf. Leur perturbation en renversant IFT88 et Elipsa a causé un défaut notoire sur la rétraction du processus basal. L'analyse en accéléré du knock-down de la N-cadhérine, un traitement connu pour provoquer une grave perturbation de l'ONL, a montré que les progéniteurs des photorécepteurs ectopiques migraient initialement de manière apparemment aléatoire, prolongeant abondamment les processus cellulaires, jusqu'à ce qu'ils rencontrent d'autres cellules pour établir rosettes cellulaires dans lesquelles ils sont restés acquérant la polarité de type photorécepteur.

Conclusion Dans l'ensemble, nos observations indiquent une régulation complexe de la dynamique des progéniteurs des photorécepteurs pour former l'ONL rétinien, avant les étapes de maturation post-mitotique.


Recherche biomédicale III : communication entre le cerveau et les autres organes

La puberté humaine est un processus dynamique qui initie les interactions complexes de l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (axe HPG), qui fait référence à des glandes endocrines uniques en tant qu'entités individuelles. L'axe HPG joue un rôle essentiel dans le développement et la régulation de nombreux systèmes du corps, en particulier la reproduction 39 . L'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH), sécrétée par l'hypothalamus dans le cerveau, circule dans la partie antérieure du système porte hypophysaire hypophysaire et se lie aux récepteurs des cellules sécrétoires de l'adénohypophyse 40 . En réponse à la stimulation de la GnRH, ces cellules produisent de l'hormone lutéinisante et de l'hormone folliculo-stimulante, qui circulent dans la circulation sanguine 41 . Par conséquent, un adolescent se développe en un adulte mature avec un corps capable de reproduction sexuée 42 . Le syndrome de Kallmann (SK) est une maladie génétique connue pour empêcher une personne de commencer ou de terminer complètement la puberté. Dans une étude montrant que le WDR11 la mutation du gène est impliquée dans la pathogénicité du SK, le poisson zèbre wdr11 gène a été démontré pour être exprimé dans la région du cerveau, indiquant un rôle potentiel pour l'interaction protéine WDR11-EMX1 43 .

De plus, l'inflammation aiguë est connue pour initier une réponse régénérative après une lésion traumatique dans le cerveau du poisson zèbre adulte. Le récepteur de cystéinyl leucotriène 1 (cysltr1)–leucotriène C4 (LTC4) est nécessaire et suffisante pour une prolifération et une neurogenèse améliorées 44 . LTC4, l'un des ligands de CysLT1, se lie à son récepteur Cysltr1 exprimé sur les cellules gliales radiales dans le cerveau du poisson zèbre 44 . Dans une étude de Kyritsis et al., cysltr1 était de plus en plus exprimé sur les cellules gliales radiales après un traumatisme crânien, suggérant une interaction entre les composants de la réponse inflammatoire et le système nerveux central lors d'un traumatisme crânien 44 .

La famille nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase (NOX) est impliquée dans la production d'espèces réactives de l'oxygène en réponse à divers signaux extracellulaires. L'oxydase double membre de la famille NOX (DUOX) a été identifiée comme la NADPH oxydase thyroïdienne. Chez l'homme, des mutations DUOX2 ont été identifiées chez des enfants diagnostiqués avec une hypothyroïdie congénitale. Récemment, il a été démontré qu'en plus des glandes thyroïdes goitreuses et du retard de croissance, des anomalies de la réponse à l'anxiété et des interactions sociales ont été trouvées chez duo-knockout poisson zèbre 45 . Ces résultats suggèrent que duoLe poisson-zèbre knock-out pourrait servir de modèle animal efficace pour les études sur le développement de la thyroïde et les maladies neurologiques associées, notamment la déficience intellectuelle et l'autisme.

Un grand pourcentage d'enfants atteints de TSA sont connus pour avoir des problèmes gastro-intestinaux, tels que la constipation, la diarrhée et les douleurs abdominales. Des études récentes sur l'axe cerveau-intestin ont également montré que les interactions avec les communautés microbiennes associées à l'hôte, soit directement par les métabolites microbiens, soit indirectement via les systèmes immunitaires, métaboliques ou endocriniens, peuvent constituer des sources d'indices environnementaux. Les signaux moléculaires de l'intestin fournissent des indices environnementaux pour la communication entre l'intestin et le cerveau pendant les épisodes liés à l'anxiété, la dépression, la cognition ou les troubles du spectre autistique (TSA) 46 . De plus, la modulation des voies de signalisation intrinsèques et des signaux extrinsèques dans les bactéries intestinales résidentes améliore la stabilité de la -caténine dans les cellules épithéliales intestinales, favorisant la prolifération cellulaire 47 .


La voie de sécrétion des protéines

La voie de sécrétion génère, trafique et traite des protéines destinées à l'espace extracellulaire ou à la membrane plasmique. Il comprend le réticulum endoplasmique (RE), le compartiment intermédiaire ER-Golgi (ERGIC), le complexe de Golgi et les vésicules qui transportent la cargaison entre eux (Fig. 2). La synthèse et la glycosylation des protéines se produisent respectivement dans le RE et l'appareil de Golgi. Le complexe de protéine d'enveloppe II (COPII) facilite la sélection de la cargaison, la formation de vésicules et le trafic antérograde du RE vers le Golgi, tandis que le transport rétrograde se produit dans les vésicules COPI (Fig. 1F Fig. 2). Divers complexes protéiques fonctionnent à chaque étape de cette voie pour recruter les protéines Rab GTPases et SNARE, qui dirigent et attachent les vésicules pour cibler les organites et faciliter la fusion membranaire.

Composants des voies sécrétoires étudiés chez le poisson zèbre et impliqués dans des maladies humaines. Les protéines des voies sécrétoires impliquées dans les maladies humaines sont représentées en noir avec les outils correspondants du poisson zèbre pour les étudier en rouge. ATN, anomalies du tube neural CLSD, dysplasie cranio-lenticulaire-suturale CDAII : anémie dysérythropoïétique congénitale II CMRD, maladie de rétention des chylomicrons LGMD, dystrophie musculaire des ceintures SEDL, dysplasie spondyloépiphysaire tardive liée à l'X, déficience intellectuelle.

Composants des voies sécrétoires étudiés chez le poisson zèbre et impliqués dans des maladies humaines. Les protéines des voies sécrétoires impliquées dans les maladies humaines sont représentées en noir avec les outils correspondants du poisson zèbre pour les étudier en rouge. ATN, anomalies du tube neural CLSD, dysplasie cranio-lenticulaire-suturale CDAII : anémie dysérythropoïétique congénitale II CMRD, maladie de rétention des chylomicrons LGMD, dystrophie musculaire des ceintures SEDL, dysplasie spondyloépiphysaire tardive liée à l'X, déficience intellectuelle.

Les travaux sur les organismes unicellulaires et les cellules cultivées ont créé l'hypothèse que la sécrétion de protéines est uniformément régulée à travers les types de cellules. Des études chez l'homme, le poisson zèbre et d'autres vertébrés ont cependant révélé que cette voie est régulée de manière spatio-temporelle et spécifique au paralogue (Melville et Knapik, 2011 Unlu et al., 2013). Bien que toutes les cellules sécrètent des protéines, certaines – y compris les cellules B, les chondrocytes, les hépatocytes et les cellules pancréatiques endocrines et exocrines – sont considérées comme des cellules sécrétoires « professionnelles » et ces cellules étaient supposées être particulièrement sensibles à la perturbation des voies sécrétoires. Les mutants du poisson zèbre dans les gènes de la voie de sécrétion ont à la fois soutenu et réfuté cette hypothèse : certains mutants présentent des phénotypes dans la plupart des cellules hautement sécrétoires, tandis que d'autres ont des phénotypes limités à un sous-ensemble de cellules.

Le point de vue émergent est que la machinerie sécrétoire fait partie intégrante de la morphogenèse et de la fonction des organes d'une manière spécifique à la cellule. La disponibilité des mutants génétiques du poisson zèbre et fluorescent in vivo reporters fournit un nouvel aperçu des fonctions de l'organisme de la voie de sécrétion. Les effets de la perturbation des voies sécrétoires concernant le développement et la maladie sont discutés ci-dessous.

Conséquences développementales de la perturbation des voies sécrétoires

Le complexe COPII comprend la Sar1 GTPase, les dimères Sec23-Sec24 de la couche interne et les hétérotétramères Sec13-Sec31 de la couche externe (Fig. 2 Kaiser et Schekman, 1990 Novick et al., 1980). Mutants de poisson zèbre de sec23a (broyeur) et sec24d (bouledogue) développent une dysmorphologie craniofaciale, des nageoires pectorales pliées et un corps court (Lang et al., 2006 Sarmah et al., 2010). Ceux-ci sont attribués à un échec de la sécrétion de la matrice extracellulaire (ECM) au cours de la différenciation des chondrocytes. Les animaux déficients en Sec23A et Sec24D ne parviennent pas à exporter le collagène et d'autres protéines N-glycosylées du RE des chondrocytes, ce qui arrête la différenciation et provoque finalement la mort cellulaire (Lang et al., 2006 Sarmah et al., 2010 Unlu et al., 2013), tandis que la sécrétion de collagène et le développement squelettique sont intacts lors de l'épuisement du paralogue proche Sec24C (Sarmah et al., 2010). Les mutations Sec23B chez l'homme et le poisson zèbre perturbent l'érythropoïèse (Bianchi et al., 2009 Schwarz et al., 2009), un phénotype différent des défauts chondrocytes observés chez broyeur et bouledogue mutants. Ces phénotypes COPII sont distincts des mutants nains éternuement, heureux et Dopé, qui perturbent les gènes codant pour les sous-unités α, et β′ du complexe COPI, respectivement (Fig. 2), qui sont caractérisés par des défauts dans la formation de la notocorde et du mélanosome (Coutinho et al., 2004). Ces données suggèrent que bien que COPI et COPII soient nécessaires pour une sécrétion efficace et un recyclage membranaire dans toutes les cellules, la perte de membres spécifiques de chaque complexe a des effets profonds et disparates sur un sous-ensemble de cellules. Des mutations dans des composants individuels de COPII provoquent un éventail de phénotypes dans des types de cellules hautement sécrétoires dans des organes tels que le cartilage, la notocorde, les yeux et l'intestin (Niu et al., 2012 Schmidt et al., 2013 Townley et al., 2008 Townley et al., 2012) et dans les érythrocytes (Bianchi et al., 2009 Schwarz et al., 2009 Unlu et al., 2013), alors que les cellules qui dépendent de la formation de vacuoles sont les plus sensibles à la déplétion COPI.

Alors, comment les mécanismes de régulation transcriptionnelle dirigent-ils la voie sécrétoire pour assurer une disponibilité en temps opportun des couches spécifiques à la cargaison ? Un criblage à grande échelle chez le poisson zèbre a identifié le se sentir bien mutant, qui porte un variant faux-sens dans le creb3L2 gène (Driever et al., 1996 Knapik, 2000 Neuhauss et al., 1996) - le premier facteur de transcription connu qui régule la disponibilité des composants COPII sec24d et sec23a, mais non sec24c (Melville et al., 2011). Similitudes entre se sentir bien, broyeur et bouledogue les phénotypes mutants suggèrent qu'un « module de sécrétion » composé de Creb3L2-Sec23A-Sec24D se spécialise dans la sécrétion de procollagène. Étant donné que le poisson zèbre dépourvu de Sec24C ne manifeste pas de dysmorphologie squelettique et que le gène n'est pas une cible de Creb3L2, il est probable que d'autres modules de sécrétion spécifiques à la cargaison régulent sec24c et d'autres gènes dans cette voie. De futures études sur le poisson zèbre et d'autres modèles animaux seront nécessaires pour déchiffrer le code des réseaux sécrétoires physiologiquement pertinents et spécifiques à la cargaison.

Maladies causées par la perturbation des voies sécrétoires chez le poisson zèbre et les humains

Plusieurs syndromes humains sont associés à des anomalies des voies sécrétoires (De Matteis et Luini, 2011), dont certains sont récapitulés dans des mutations des gènes orthologues du poisson zèbre (Fig. 2). L'identification simultanée de broyeur/sec23a mutants chez le poisson zèbre et les patients atteints de variantes SEC23A/dysplasie cranio-lenticulo-suturale (CLSD) (Boyadjiev et al., 2006 Lang et al., 2006) fournit un excellent exemple de convergence entre la génétique humaine et la biologie du développement du poisson zèbre pour découvrir les ramifications physiologiques causées en perturbant les processus biologiques cellulaires de base. Les deux broyeur les mutants et les patients atteints de CLSD présentent une dysmorphologie craniofaciale et des défauts du squelette axial attribués à l'arriéré des protéines ECM dans le RE (Boyadjiev et al., 2006 Lang et al., 2006). Le étroitement lié SEC23B Le gène est muté chez les patients atteints d'anémie dysérythropoïétique congénitale de type II qui ont des érythroblastes multinucléés dans la moelle osseuse, un phénotype récapitulé chez le poisson zèbre sec23b morphants (Bianchi et al., 2009 Schwarz et al., 2009).

On ne sait pas pourquoi les mutations des paralogues SEC23A et SEC23B, qui ne diffèrent que par une extension de 18 acides aminés, provoquent des phénotypes si différents. Une possibilité est que les différences spatio-temporelles dans l'expression confèrent des fonctions spécifiques aux cellules de certains gènes complexes COPII. Cependant, comme sar1a et sar1b sont exprimés de manière ubiquitaire au début du développement et s'enrichissent dans des tissus distincts plus tard (E.W.K., observations non publiées), il est peu probable que leur modèle d'expression génique soit le seul responsable des phénotypes divergents observés chez ces mutants.

Les phénotypes craniofaciaux des mutants COPII suggèrent que les chondrocytes sont très sensibles aux défauts de sécrétion de la MEC. Cela prédit que d'autres manipulations qui bloquent la voie sécrétoire provoqueraient également une dysmorphologie craniofaciale. Ceci, cependant, n'est pas étayé par les données provenant du poisson zèbre ou des humains lorsque les facteurs fonctionnant à d'autres étapes de la voie sécrétoire sont épuisés. Le complexe de particules de protéine de transport (TRAPP) attache les vésicules dérivées du RE à la membrane cis-Golgi (Fig. 2 et Sacher et al., 2008). Fibroblastes de patients atteints de TRAPPC11 ou TRAPPC2 mutations (Bögershausen et al., 2013 Scrivens et al., 2009) et les cellules cultivées dépourvues de TRAPPC11 (Scrivens et al., 2011 Wendler et al., 2010) présentent une fragmentation de Golgi et une rétention de protéines sécrétoires. Cependant, lorsque ces protéines sont épuisées dans des organismes entiers, leurs rôles spécifiques aux cellules sont découverts : les patients atteints de TRAPPC2 mutation développent une dysplasie spondyloépiphysaire tardive (SEDT) caractérisée par des anomalies squelettiques, une petite taille et une microcéphalie (Gedeon et al., 1999 Huson et al., 1993). Ceci est récapitulé dans trappc2 morphants de poisson zèbre, qui ont un tronc court et une microcéphalie (A. M. Vacaru et K. C. Sadler, non publié). La petite taille et/ou le phénotype du tronc pourraient refléter un défaut dans la formation des chondrocytes ou dans le dépôt de la MEC, comme chez les mutants COPII, mais les patients et les poissons zèbres avec TRAPPC11 mutation présente très différemment. La mutation TRAPPC11 chez l'homme provoque une myopathie, une déficience intellectuelle et des mouvements hyperkinétiques (Bögershausen et al., 2013). Fait intéressant, le poisson zèbre foie gras (foigr) mutants porteurs d'une insertion virale mutagène dans le trappc11 gène présentent un phénotype différent des autres modèles de perturbation du complexe TRAPP : ils développent une stéatose hépatique, une hépatomégalie, des intestins et des mâchoires plus petits, et des anomalies des nageoires (Cinaroglu et al., 2011 Sadler et al., 2005). Les foigr/trappc11 le phénotype de la stéatose hépatique est partiellement attribué à l'activation de la réponse protéique dépliée (Cinaroglu et al., 2011) cependant, ni les cellules cultivées de mammifères qui sont épuisées en TRAPPC11 ni trappc2 les morphants induisent cette réponse (A.M.V. et K.C.S., observations non publiées), mettant en évidence l'utilité de in vivo études de biologie cellulaire chez les vertébrés.

Les phénotypes uniques qui différencient la perturbation du complexe TRAPP des mutations COPII ou COPI indiquent qu'un blocage global de la sécrétion de protéines n'est pas le seul mécanisme qui sous-tend leurs phénotypes associés. De plus, bien que l'épuisement des facteurs complexes individuels de TRAPP ou de COP ait des effets similaires dans des cellules isolées, les conséquences physiologiques ne pourraient pas être prédites sans l'utilisation d'animaux entiers. Ces résultats indiquent des rôles spécifiques aux cellules et au développement pour chaque gène impliqué dans la sécrétion de protéines et soulignent la nécessité de modèles animaux entiers comparatifs pour déchiffrer les fonctions cellulaires et physiologiques de cette voie.


Chapitre 9 - Analyse de la structure et de la fonction des cils chez le poisson zèbre

Les cils sont des protubérances à base de microtubules à la surface de la plupart des cellules eucaryotes. On les trouve dans la plupart, sinon dans tous les organes des vertébrés. Des cils proéminents se forment dans les structures sensorielles, l'œil, l'oreille et le nez, où ils sont cruciaux pour la détection des stimuli environnementaux, tels que la lumière et les odeurs. Les cils sont également impliqués dans les processus de développement, y compris la formation d'asymétrie gauche-droite, la morphogenèse des membres et la structuration des neurones dans le tube neural. Certains cils, tels que ceux trouvés dans les canaux néphriques, auraient des rôles mécanosensoriels. Le poisson zèbre s'est avéré très utile dans l'analyse génétique et l'imagerie des processus liés aux cils, et dans la modélisation des mécanismes à l'origine des anomalies des cils humains, appelées ciliopathies. Un certain nombre de défauts du poisson zèbre ressemblent à ceux observés dans les ciliopathies humaines. Forward and reverse genetic strategies generated a wide range of cilia mutants in zebrafish, which can be studied using sophisticated genetic and imaging approaches. In this chapter, we provide a set of protocols to examine cilia morphology, motility, and cilia-related defects in a variety of organs, focusing on the embryo and early postembryonic development.


Glossaire

Digital scanned laser light sheet fluorescent microscopy (DSLM): An improved version of SPIM, which uses a thin laser beam rather than a full light sheet, thus reducing damage to both specimen and fluorescent dye.

Gastrulation: The phase in early embryonic development during which the three germ layers are formed: ectoderm, mesoderm and endoderm. The timing and molecular mechanism of gastrulation differ between organisms.

Genetic strain: A genetically uniform group of animals, used in laboratory experiments. A genetic strain can be developed by inbreeding, mutation or genetic engineering.

Single-plane illumination microscopy (SPIM): This method allows 3D observation of processes in living organisms, even in deep tissue layers. It detects fluorescence at an angle of 90° relative to the axis of illumination with a sheet of laser light, permitting optical cutting. The specimen is not positioned on a microscope slide but in a liquid-filled chamber which is rotated during observation.


Math Model Helps Show How Zebrafish Get Their Stripes

A mathematical model developed by Brown University researchers, including doctoral student in Applied Mathematics Alexandria Volkening, is shedding new light on how zebrafish get their iconic stripes. The model helps to demonstrate how two dynamic processes—the movement of pigment cells across the skin, and the birth and death of cells as the fish grows—combine to keep zebrafish stripes in line.

Zebrafish have become quite a popular model organism for biology researchers over the past few decades. The small freshwater fish begin life as transparent embryos and develop in just a few months to full size, giving scientists the chance to watch their development in detail. The emergence of their namesake stripes of dark blue and bright yellow has been the subject of much research. The stripes have been shown to be the result of interplay between three types of pigment cells: black melanophores, yellow xanthophores, and silvery iridophores.

“The stripe pattern forms dynamically as the fish develops,” said Volkening, who is the lead author on the new paper. “It’s not like these pigment cells are filling out some kind of prepattern that’s already there. It’s the interactions of the cells over time that causes the patterns to form. We wanted to build a model that simulates this based as much as possible on what’s known about the biology.”


Voir la vidéo: Thyroïde, coeur u0026 poisson-zèbre Images de Sciences #10 (Décembre 2022).