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Qu'est-ce qui vient en premier, PCR ou électrophorèse sur gel ?

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Si je veux découvrir qu'un groupe de patients a le gène anormal du cancer BCR-ABL, comment puis-je bénéficier de la PCR et des techniques d'électrophorèse sur gel ? Je suis un peu perdu à essayer de déterminer ce qui vient en premier et quelle est la fonction exacte de chaque appareil, j'ai lu tout le processus de clonage de gènes dans mon livre de biologie mais je n'ai pas pu l'absorber car il est si complexe.


La PCR vient en premier. Si la PCR fonctionne correctement, un produit spécifique sera alors amplifié. Mais vous ne pouvez pas le voir dans le petit tube PCR Eppendorf en plastique. C'est à cela que sert l'électrophorèse. Après avoir exécuté la PCR, vous exécutez les produits sur un gel d'agarose pour le visualiser (à l'aide d'un colorant fluorescent). Le gel d'agarose est juste pour voir si la PCR a fonctionné.


Premiers PCR et Gel chez Biomakespace

Nous avons clôturé le trimestre de la Saint-Michel avec notre première session pratique au Biomakespace nouvellement ouvert ! Notre objectif pour la journée était de tester les installations de Biomakespace en exécutant une PCR suivie d'une électrophorèse de l'ADN - deux techniques de biologie moléculaire très importantes.

La PCR, abréviation de Polymerase Chain Reaction, est une technique extrêmement utile qui nous permet d'amplifier massivement une région spécifique d'une molécule matrice d'ADN. Un modèle couramment utilisé est l'ADN génomique extrait de tissus ou de cellules, mais nous utilisions une sélection de BioBricks laissés par les équipes précédentes de Cambridge iGEM. Les BioBricks sont une sélection de « composants biologiques » standardisés qui sont insérés dans des molécules d'ADN circulaires plus grandes appelées plasmides. Les BioBricks sont généralement distribuées sous forme d'échantillons d'ADN sec de 2 à 3 ng dans des plaques en plastique à 384 puits que nous avons dissoutes dans l'eau le jour même.

Puisque nous prévoyons d'utiliser l'assemblage Gibson pour construire des circuits génétiques sensibles à la lumière le prochain terme, nous voulions isoler sélectivement la séquence dont nous avons besoin du reste du plasmide et personnaliser les extrémités. Pour ce faire, nous devions ajouter des amorces soigneusement sélectionnées aux échantillons PCR. La semaine dernière (19/11/17), nous avons eu une réunion au cours de laquelle nous avons discuté de certaines des bases d'une bonne sélection d'amorces et conçu quelques ensembles d'amorces prédisant pour amplifier les séquences que nous voulions - merci à Jarrod Shilts pour nous avoir aidés ! Les amorces sont de petits morceaux d'ADN, longs d'environ 20 nucléotides, qui peuvent être commandés sur mesure auprès de diverses entreprises. Le nôtre est venu sous forme de minuscules pastilles d'ADN séché dans des tubes que nous avons dissous et dilués à la concentration de travail. Nous avions quelques jeux d'amorces : un jeu destiné à se lier et à amplifier directement depuis le début et la fin des régions codantes des gènes BioBrick, et deux autres jeux qui amplifiaient à partir de séquences communes partagées entre les plasmides dans lesquels nos BioBricks étaient insérés.

Pendant que notre PCR fonctionnait (sur un thermocycleur assez ancien), nous avons mis en place le gel que nous allions utiliser pour séparer et visualiser les fragments d'ADN que nous espérions générer. L'électrophorèse de l'ADN repose sur le fait que l'ADN est chargé négativement et se déplacera donc de la cathode (électrode négative) vers l'anode (électrode positive) lorsqu'il est placé dans un champ électrique. Le gel fournit un environnement qui ralentit davantage les morceaux d'ADN plus gros que les plus petits, ce qui signifie que les plus petits migrent plus rapidement et donc l'ADN se sépare par taille. En chargeant un échantillon marqueur, avec plusieurs morceaux d'ADN de longueur connue, on peut estimer la taille de l'ADN dans d'autres voies de gel (par exemple, celles amplifiées par PCR). Nous avons dû faire un petit bricolage pour garder le gel liquide dans le moule pendant qu'il durcissait, ce qui fonctionnait avec seulement un peu de fuite. Juste avant de verser, nous avons ajouté un colorant qui devient fluorescent au contact de l'ADN. Après avoir passé le gel, ce colorant nous a permis de voir nos produits PCR sous forme de bandes lumineuses lorsque le fluorophore était excité par un transilluminateur à lumière bleue.

L'image du gel n'est pas aussi claire qu'on pourrait le souhaiter (en partie à cause d'un appareil photo de téléphone louche !), mais il y a des bandes très claires indiquant que la plupart de nos PCR ont réussi ! Contenu de la piste : la piste la plus à l'extérieur de chaque côté contenait une échelle de marqueurs, les pistes 2 à 7 étaient des échantillons amplifiés avec des amorces directement sur les régions codant pour le gène (conçues la semaine dernière), les pistes 8 à 13 étaient des échantillons amplifiés avec des amorces plasmidiques génériques provenant de sur le site Web du référentiel BioBrick, les voies 14 à 19 ont été amplifiées avec des amorces plasmidiques génériques similaires (également conçues la semaine dernière).

Excellent travail à tous ceux qui ont aidé à la conception de l'amorce et aux travaux pratiques ! Les résultats indiquent que nous avons plusieurs ensembles d'amorces qui seront utiles comme points de départ pour produire des amorces en surplomb nécessaires à la préparation des séquences pour l'assemblage Gibson. Il y a cependant quelques voies qui ont produit des résultats inattendus. Par exemple, les pistes 13 et 19, qui ont utilisé le même modèle, n'affichent pas les bandes des deux ensembles d'amorces génériques. À l'inverse, les voies 10 et 16 ont montré des bandes qui semblent un peu plus larges que prévu. Ce sont deux choses qui peuvent nécessiter une enquête plus approfondie - quelque chose que l'un de nos chefs de projet peut avoir le temps de faire pendant les vacances.

Merci à tous ceux qui sont venus à nos événements et réunions ce trimestre, nous nous attendons à ce que les choses deviennent plus excitantes après les vacances d'hiver alors que nous essayons d'assembler nos circuits sensibles à la lumière et de les démarrer dans E. coli bactéries ! Enfin, un grand merci à Katia Smith-Litière et en particulier Jenny Molloy pour nous avoir aidés avec la paperasse, les commandes et plus encore, ce qui nous a permis de démarrer et de fonctionner chez Biomakespace ce trimestre.


Électrophorèse sur gel

Nos rédacteurs examineront ce que vous avez soumis et détermineront s'il faut réviser l'article.

Électrophorèse sur gel, l'une des nombreuses techniques utilisées pour séparer des molécules d'ADN, d'ARN ou de protéines sur la base de leur taille ou de leur charge électrique. L'électrophorèse sur gel a une variété d'applications, par exemple, elle est utilisée dans les empreintes génétiques et la détection de variantes génétiques et de protéines impliquées dans la santé et la maladie ainsi que dans la détection et la purification d'acides nucléiques et de protéines pour la recherche. Il est également utilisé pour faciliter la détection d'agents pathogènes (organismes pathogènes) qui peuvent être présents dans le sang ou d'autres tissus ou dans des sources telles que les aliments. Dans de nombreux cas, les acides nucléiques ou les protéines qui sont détectés et purifiés par électrophorèse sur gel sont étudiés plus avant au moyen du séquençage de l'ADN ou de la spectrométrie de masse.

L'appareil d'électrophorèse sur gel se compose d'un gel, qui est souvent fabriqué à partir d'agar ou de polyacrylamide, et d'une chambre d'électrophorèse (généralement une boîte ou un réservoir en plastique dur) avec une cathode (borne négative) à une extrémité et une anode (borne positive) à l'extrémité extrémité opposée. Le gel, qui contient une série de puits à l'extrémité cathodique, est placé à l'intérieur de la chambre et recouvert d'une solution tampon. Les échantillons sont ensuite chargés dans les puits avec une pipette. La chambre est connectée à une alimentation électrique qui, lorsqu'elle est allumée, applique un champ électrique au tampon. Le champ électrique provoque la migration de molécules chargées négativement à travers le gel vers l'anode. (L'ADN et l'ARN sont des protéines chargées négativement qui doivent être traitées avec un détergent pour leur donner une charge négative.) Le mouvement des molécules est influencé par la matrice de gel poreux de sorte que les molécules plus grosses et plus lourdes se déplacent relativement lentement, tandis que les molécules plus petites et plus légères se déplacent plus vite. La densité des pores et le type de substance utilisée pour fabriquer le gel influencent davantage la vitesse de migration des molécules. Souvent, une «échelle» colorée ou un marqueur avec plusieurs molécules de poids moléculaires connus et variables est utilisé avec des échantillons expérimentaux pour servir de référence pour la taille. Le colorant permet la visualisation du marqueur lorsqu'il se déplace à travers les échantillons de gel sont généralement également teints pour la visualisation. Un colorant connu sous le nom de bromure d'éthidium, qui émet une fluorescence sous la lumière ultraviolette, est fréquemment utilisé pour une visualisation nette des échantillons d'ADN.


L'électrophorèse sur gel peut être utilisée pour trouver des gènes associés à une maladie

Dans ce cas simulé, les chercheurs recherchent des fragments d'ADN que l'on ne trouve que chez des patients atteints d'une maladie inflammatoire de l'intestin.

Ces fragments d'ADN sont présentés sous forme de « bandes » dans les résultats de l'électrophorèse (voir l'image).

Si les fragments ne se trouvent que chez les personnes atteintes de la maladie, cela suggère que les fragments contiennent l'ADN d'une variante génétique qui pourrait signifier qu'une personne est plus susceptible de contracter la maladie.

La photo montre les résultats de l'analyse ADN de sept personnes différentes. La première ligne (1) représente une « échelle », qui vous permet de déterminer la taille des fragments d'ADN qui ont été séparés.

Imaginons que l'ADN chargé dans les puits 2, 3, 4 et 5 provienne de patients atteints de la maladie, et que l'ADN chargé dans les puits 6, 7, 8 et 9 provienne de personnes qui n'ont pas la maladie. Pouvez-vous voir que chez trois des quatre patients atteints de la maladie, il y a une bande supplémentaire dans le schéma ?

La personne dont l'ADN est chargé dans la piste 2 est également atteinte de la maladie, mais les résultats ne montrent pas le même motif de bandes que les autres personnes atteintes de la maladie. Cela suggère que plus d'une variation génétique peut être associée à cette maladie.


Aide à la PCR et à l'électrophorèse sur gel. Ne pas avoir de groupes - (sept./07/2012)


Quelqu'un peut-il m'aider ou me conseiller. Je suis étudiant et j'essaie d'amplifier l'ADNc produit à partir d'ARN sans succès depuis plusieurs semaines maintenant afin de compléter une séquence de gènes où j'ai un petit écart d'environ 40 nucléotides.
J'ai effectué la synthèse du premier brin RT-PCR à l'aide du kit de synthèse d'ADNc Fermatas Revert Aid Firrst Strand et après 10 tentatives, j'ai obtenu un groupe en utilisant les éléments suivants :
12ul MyTaq
Amorce avant 1ul 18s
Apprêt inverse 1ul 18s
1ul d'ADNc concentré
9.5ul H2O sans nucléase

C'était pour vérifier qu'il y avait effectivement de l'ADNc produit.
Des amorces ont ensuite été conçues de part et d'autre du "segment manquant" d'environ 45 nucléotides.

Pour amplifier le gène en question (gène POR), j'ai essayé plusieurs choses.
Au départ j'ai utilisé :
16.25ul sans nucléase H20
Tampon 5ul
0,5 ul de dNTP
1ul Fwd Primer
1ul Rev Primer
Modèle 1ul
0.25ul Enzyme (Phusion Hotstart II)

Les conditions de PCR utilisées étaient
1 cycle :
98oC pendant 30 secondes
39 cycles de :
98oC 10 secondes
54oC 30 secondes
72oC 30 secondes
1 cycle :
72oC 5 minutes

J'ai maintenant essayé de modifier les éléments suivants :
Passage à l'enzyme Velocity
PCR ensemencée
Réduire de moitié la quantité d'enzymes
Réduire le temps de prolongation
Modification de la température de recuit de 54oC à 50oC et aussi 45oC
Ajouter plus de modèle
Augmentation du temps de recuit à 60 secondes

Tout ce qui précède n'a produit aucune bande, aucun frottis ou le produit PCR toujours dans les puits après que le gel a été utilisé.

Je suis vraiment perplexe maintenant et j'aimerais avoir des conseils.
J'espère avoir inclus tout ce dont j'ai besoin dans ce post.

Merci d'avance.

Comment vos amorces ont-elles été conçues ? Y a-t-il quelque chose de spécial à propos du modèle (GC élevé, GC faible ?, structure) ?

J'ai déjà 2 séquences, l'une est l'extrémité 5 & 39 du gène et l'autre l'extrémité 3 & 39. Il y a cependant un écart d'environ 45 nucléotides au milieu que j'essaie d'amplifier. Les amorces ont été conçues à partir de ces séquences de chaque côté de la brèche, ont une longueur de 20 nucléotides et ne sont pas particulièrement riches en GC.

Ceux-ci ressemblent à des amorces parfaitement raisonnables. Comment connaître la longueur de cet écart ? Êtes-vous capable d'amplifier les régions connues de votre gène à partir du même échantillon de matrice ?
Peut-être que l'écart est vraiment un intron, et vous avez amplifié l'ADN génomique plutôt que l'ADNc.

J'ai fait une recherche Blast et comparé les 2 séquences de la même famille, en utilisant ClustalW2 et j'ai eu une idée de la longueur de l'écart.

Et, pouvez-vous amplifier les portions pour lesquelles vous avez une séquence à partir de votre modèle d'ADNc ?
Vous pouvez amplifier l'ADN génomique avec les deux amorces dont vous disposez. Si vous obtenez un résultat court, vous comblerez l'écart. Si vous obtenez un résultat long, vous saurez qu'il y a un intron. Quel est l'objectif final ? Essayez-vous de faire le gène? Si c'est le cas, vous pouvez probablement substituer l'une des séquences homologues que vous avez apparemment trouvées aux 9 aa qui manquent.

Les séquences que j'ai déjà nous ont été données avec plusieurs autres d'un autre département de recherche et lorsque nous avons fait une recherche BLAST de toutes dans la base de données, les deux que nous avons sont celles qui sont apparues comme le gène POR mais il y a un petit séquence manquante entre eux.

Donc, je vous recommanderais d'essayer d'amplifier les séquences que vous savez déjà présentes. Cela vérifiera que votre ADNc (ou peut-être votre ADN génomique) est bien présent et de qualité suffisante. J'essayerais aussi des dilutions de votre modèle.

J'ai déjà essayé des dilutions du template, mais vais essayer les séquences que je connais déjà, merci


Qu'est-ce qui vient en premier, PCR ou électrophorèse sur gel ? - La biologie

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Cette action ne peut pas être annulée. Cela supprimera définitivement toutes les questions pratiques.

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L'agarose extrait des algues marines trouve une utilisation dans (AIPMT Pre. - 2011)
1. Spectrophotométrie
2. Culture tissulaire
3. PCR
4. Électrophorèse sur gel

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JE VOUDRAIS EN SAVOIR PLUS

Laquelle des techniques suivantes a permis de modifier génétiquement des organismes vivants ? (AIPMT Mains-2011)
1. Techniques d'ADN recombinant
2. Diffraction des rayons X
3. Étiquetage des isotopes plus lourds
4. Hybridation

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JE VOUDRAIS EN SAVOIR PLUS

Pour la transformation, les microparticules enrobées d'ADN à bombarder au canon à gènes sont constituées de :(AIPMT Pre. 2012)
1. Argent ou Platine
2. Platine ou zinc
3. Silicium ou Platine
4. Or ou tungstène

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JE VOUDRAIS EN SAVOIR PLUS

Laquelle est une déclaration vraie concernant l'ADN polymérase utilisée en PCR (AIPMT Pre. 2012)
1. Il est utilisé pour ligaturer l'ADN introduit dans la cellule receveuse
2. Il sert de marqueur sélectionnable
3. Il est isolé d'un virus
4. Il reste actif à haute température

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JE VOUDRAIS EN SAVOIR PLUS

La PCR et le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction sont les méthodes utilisées pour : (AIPMT Pre. 2012)
1. Étude des enzymes
2. Transformation génétique
3. Séquençage de l'ADN
4. Empreintes génétiques

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JE VOUDRAIS EN SAVOIR PLUS

La figure ci-dessous est la représentation schématique du vecteur E.Coli pBR 322. Laquelle des options proposées identifie correctement son ou ses certains composants ? (AIPMT Pré. 2012)

1. ori - enzyme de restriction originale
2. pression osmotique rop-réduite
3. Hind III, EcoRI - marqueurs sélectionnables
4. amp R , tet R - gènes de résistance aux antibiotiques

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JE VOUDRAIS EN SAVOIR PLUS

La figure ci-dessous montre trois étapes (A, B, C) de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Sélectionnez l'option donnant ‘identification correcte avec ce qu'elle représente ?              (AIPMT Mains. - 2012)   

Options :
1. B - Dénaturation à une température d'environ 98°C séparant les deux brins d'ADN.
2. A - Dénaturation à une température d'environ 50ଌ
3. C - Extension en présence d'ADN polymérase thermostable
4. A - Recuit avec deux jeux d'amorces


  • Science in Personal and Social Perspective, Content Standard F « De nombreuses maladies peuvent être prévenues, contrôlées ou guéries grâce aux connaissances acquises grâce à la science.
  • Norme de contenu A : « À la suite des activités de la 9e à la 12e année, tous les élèves devraient développer les capacités nécessaires pour faire de la recherche scientifique, Compréhension de la recherche scientifique »
  • Contenu Standard E : « À la suite des activités de la 9e à la 12e année, tous les élèves devraient développer des capacités de conception technologique, une compréhension de la science et de la technologie »
  • Programme d'études standard de la Caroline du Nord pour la biologie, objectif 1
  • Programme d'études standard de la Caroline du Nord pour la biologie, objectif 3.04
  • Programme d'études standard de la Caroline du Nord pour la biologie, objectif 4.03

NanoArmoring of Enzymes : conception rationnelle d'enzymes enveloppées de polymère

Caterina M. Riccardi , . Challa V. Kumar , dans Méthodes en Enzymologie , 2017

3.1 Conjugaison enzymatique au PAA et caractérisation par électrophorèse sur gel d'agarose

Une électrophorèse sur gel d'agarose a été effectuée pour vérifier la conjugaison complète des enzymes au PAA en solution (figure 1A). Le GOx-HRP-PAA nanoblindé (piste 3) a montré une mobilité électrophorétique accrue vers l'électrode positive par rapport aux contrôles GOx/HRP (piste 1) et GOx/HRP/PAA (piste 2). L'augmentation de la charge négative est due à la fixation covalente de l'enzyme (NH2 groupes) au PAA chargé négativement (groupes COOH), ce qui indique également qu'aucune enzyme non conjuguée n'est restée une fois la réaction EDC terminée (Schéma 3). Normalement, la réaction d'EDC est terminée à 40 % à 50 %, mais nous avons obtenu une conjugaison complète en raison du rapport optimal possible des enzymes au polymère et de la concentration élevée d'EDC et des conditions suivies. Une autre raison est que l'interverrouillage lui-même devrait être efficace, car pas 100 % des groupes carboxyles ou amines disponibles n'ont besoin de réagir. Une fraction substantielle doit réagir pour verrouiller solidement les composants dans la matrice fibreuse. Ainsi, il existe une marge d'erreur importante qui est autorisée dans l'étendue de la réticulation nécessaire pour un emboîtement complet des composants.

Fig. 1 . (A) Gel d'agarose du conjugué GOx-HRP-PAA en solution (Piste 3, rapport de concentration de 16:3:10 000M GOx:HRP:PAA), contrôles correspondants de GOx/HRP (Piste 1, mélange simple en solution à un rapport de concentration de 16:3 μM GOx:HRP) et le mélange physique GOx/HRP/PAA en solution avant le traitement EDC (Piste 2). (B) SDS-PAGE du conjugué GOx-HRP-PAA (piste 4) montre l'augmentation du poids moléculaire par rapport aux contrôles correspondants des mélanges physiques GOx/HRP (piste 2) et GOx/HRP/PAA (piste 3). Des marqueurs de poids moléculaire standard sont indiqués (pistes 1 et 5).

Reproduit de Riccardi, C. M., Mistri, D., Hart, O., Anuganti, M., Lin, Y., Kasi, R. M., &amp Kumar, C. V. (2016). Imbrication covalente de la glucose oxydase et de la peroxydase dans les vides du papier : « toile d'araignée » enzyme-polymère. Communications chimiques, 52, 2593–2596.

Schéma 3 . Réaction chimique entre les groupes amine et carboxyle catalysée par l'EDC.

Préparer le gel d'agarose (0,125 g d'agarose) en passant au micro-ondes une solution d'agarose (0,5%, w/v) dans du tampon Tris-acétate (40 mM, pH 7,0, 25 ml) pendant 1 min à réglage élevé. Après le passage au micro-ondes, l'agarose doit être entièrement dissous.

Laisser durcir l'agarose dans le moule à gel pendant 30 min.

Pendant ce temps, préparez les échantillons en mélangeant 5-6 μM avec tampon de charge (10 L, 50 % (v/v) de glycérol et 0,1 % (p/v) de bleu de bromophénol).

Chargez 15 L d'échantillon dans chaque puits. Une fois chargé, exécutez le gel d'agarose à 100 V pendant 30 min.

Colorer le gel avec du bleu brillant R250 (0,1 %, p/v) pendant 4 h, puis décolorer le gel avec de l'acide acétique (10 %, v/v) pendant la nuit.


10.1 Clonage et génie génétique

La biotechnologie est l'utilisation de méthodes artificielles pour modifier le matériel génétique d'organismes vivants ou de cellules afin de produire de nouveaux composés ou d'accomplir de nouvelles fonctions. La biotechnologie a été utilisée pour améliorer le bétail et les cultures depuis le début de l'agriculture grâce à l'élevage sélectif. Depuis la découverte de la structure de l'ADN en 1953, et en particulier depuis le développement d'outils et de méthodes pour manipuler l'ADN dans les années 1970, la biotechnologie est devenue synonyme de manipulation de l'ADN des organismes au niveau moléculaire. Les principales applications de cette technologie sont en médecine (pour la production de vaccins et d'antibiotiques) et en agriculture (pour la modification génétique des cultures). La biotechnologie a également de nombreuses applications industrielles, telles que la fermentation, le traitement des marées noires et la production de biocarburants, ainsi que de nombreuses applications domestiques telles que l'utilisation d'enzymes dans les détergents à lessive.

Manipulation du matériel génétique

Pour réaliser les applications décrites ci-dessus, les biotechnologues doivent être capables d'extraire, de manipuler et d'analyser des acides nucléiques.

Examen de la structure des acides nucléiques

Pour comprendre les techniques de base utilisées pour travailler avec les acides nucléiques, rappelez-vous que les acides nucléiques sont des macromolécules constituées de nucléotides (un sucre, un phosphate et une base azotée). Les groupes phosphate sur ces molécules ont chacun une charge négative nette. Un ensemble complet de molécules d'ADN dans le noyau des organismes eucaryotes est appelé le génome. L'ADN a deux brins complémentaires liés par des liaisons hydrogène entre les bases appariées.

Contrairement à l'ADN des cellules eucaryotes, les molécules d'ARN quittent le noyau. L'ARN messager (ARNm) est analysé le plus fréquemment car il représente les gènes codant pour les protéines qui sont exprimés dans la cellule.

Isolement des acides nucléiques

Pour étudier ou manipuler les acides nucléiques, l'ADN doit d'abord être extrait des cellules. Diverses techniques sont utilisées pour extraire différents types d'ADN (figure 10.2). La plupart des techniques d'extraction d'acide nucléique impliquent des étapes pour ouvrir la cellule, puis l'utilisation de réactions enzymatiques pour détruire toutes les macromolécules indésirables. Les cellules sont brisées à l'aide d'une solution détergente contenant des composés tampons. Pour éviter la dégradation et la contamination, les macromolécules telles que les protéines et l'ARN sont inactivées à l'aide d'enzymes. L'ADN est ensuite extrait de la solution à l'aide d'alcool. L'ADN résultant, parce qu'il est composé de longs polymères, forme une masse gélatineuse.

L'ARN est étudié pour comprendre les modèles d'expression des gènes dans les cellules. L'ARN est naturellement très instable car les enzymes qui décomposent l'ARN sont généralement présentes dans la nature. Certains sont même sécrétés par notre propre peau et sont très difficiles à inactiver. Semblable à l'extraction d'ADN, l'extraction d'ARN implique l'utilisation de divers tampons et enzymes pour inactiver d'autres macromolécules et préserver uniquement l'ARN.

Électrophorèse sur gel

Parce que les acides nucléiques sont des ions chargés négativement à pH neutre ou alcalin dans un environnement aqueux, ils peuvent être déplacés par un champ électrique. L'électrophorèse sur gel est une technique utilisée pour séparer les molécules chargées sur la base de la taille et de la charge. Les acides nucléiques peuvent être séparés sous forme de chromosomes entiers ou de fragments. Les acides nucléiques sont chargés dans une fente à une extrémité d'une matrice de gel, un courant électrique est appliqué et les molécules chargées négativement sont tirées vers l'extrémité opposée du gel (l'extrémité avec l'électrode positive). Les molécules plus petites se déplacent à travers les pores du gel plus rapidement que les molécules plus grosses. Cette différence de vitesse de migration sépare les fragments en fonction de leur taille. Les acides nucléiques dans une matrice de gel sont invisibles jusqu'à ce qu'ils soient colorés avec un composé qui permet de les voir, tel qu'un colorant. Des fragments distincts d'acides nucléiques apparaissent sous forme de bandes à des distances spécifiques du sommet du gel (l'extrémité de l'électrode négative) en fonction de leur taille (figure 10.3). Un mélange de nombreux fragments de tailles variables apparaît sous la forme d'un long frottis, alors que l'ADN génomique non coupé est généralement trop gros pour traverser le gel et forme une seule grande bande au sommet du gel.

Réaction en chaîne par polymérase

L'analyse de l'ADN nécessite souvent de se concentrer sur une ou plusieurs régions spécifiques du génome. Elle implique également fréquemment des situations dans lesquelles seulement une ou quelques copies d'une molécule d'ADN sont disponibles pour une analyse plus approfondie. Ces quantités sont insuffisantes pour la plupart des procédures, telles que l'électrophorèse sur gel. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique utilisée pour augmenter rapidement le nombre de copies de régions spécifiques d'ADN pour des analyses plus poussées (Figure 10.4). La PCR utilise une forme spéciale d'ADN polymérase, l'enzyme qui réplique l'ADN, et d'autres séquences nucléotidiques courtes appelées amorces qui s'apparient à une partie spécifique de l'ADN en cours de réplication. La PCR est utilisée à de nombreuses fins dans les laboratoires. Ceux-ci incluent : 1) l'identification du propriétaire d'un échantillon d'ADN laissé sur une scène de crime 2) l'analyse de paternité 3) la comparaison de petites quantités d'ADN ancien avec des organismes modernes et 4) la détermination de la séquence de nucléotides dans une région spécifique.

Clonage

En général, le clonage signifie la création d'une réplique parfaite. Typiquement, le mot est utilisé pour décrire la création d'une copie génétiquement identique. En biologie, la recréation d'un organisme entier est appelée « clonage reproductif ». Bien avant que des tentatives ne soient faites pour cloner un organisme entier, les chercheurs ont appris à copier de courtes portions d'ADN, un processus appelé clonage moléculaire.

Clonage moléculaire

Le clonage permet la création de plusieurs copies de gènes, l'expression de gènes et l'étude de gènes spécifiques. Pour obtenir le fragment d'ADN dans une cellule bactérienne sous une forme qui sera copiée ou exprimée, le fragment est d'abord inséré dans un plasmide. Un plasmide (également appelé vecteur dans ce contexte) est une petite molécule d'ADN circulaire qui se réplique indépendamment de l'ADN chromosomique dans les bactéries. Dans le clonage, les molécules plasmidiques peuvent être utilisées pour fournir un "véhicule" dans lequel insérer un fragment d'ADN souhaité. Les plasmides modifiés sont généralement réintroduits dans un hôte bactérien pour la réplication. Lorsque les bactéries se divisent, elles copient leur propre ADN (y compris les plasmides). Le fragment d'ADN inséré est copié avec le reste de l'ADN bactérien. Dans une cellule bactérienne, le fragment d'ADN du génome humain (ou d'un autre organisme à l'étude) est appelé ADN étranger pour le différencier de l'ADN de la bactérie (l'ADN hôte).

Les plasmides sont présents naturellement dans les populations bactériennes (telles que Escherichia coli) et ont des gènes qui peuvent apporter des traits favorables à l'organisme, tels que la résistance aux antibiotiques (la capacité à ne pas être affecté par les antibiotiques). Les plasmides ont été hautement modifiés en tant que vecteurs pour le clonage moléculaire et pour la production ultérieure à grande échelle de molécules importantes, telles que l'insuline. Une caractéristique intéressante des vecteurs plasmidiques est la facilité avec laquelle un fragment d'ADN étranger peut être introduit. Ces vecteurs plasmidiques contiennent de nombreuses séquences d'ADN courtes qui peuvent être coupées avec différentes enzymes de restriction couramment disponibles. Les enzymes de restriction (également appelées endonucléases de restriction) reconnaissent des séquences d'ADN spécifiques et les coupent de manière prévisible, elles sont naturellement produites par les bactéries en tant que mécanisme de défense contre l'ADN étranger. De nombreuses enzymes de restriction font des coupes décalées dans les deux brins d'ADN, de sorte que les extrémités coupées ont un surplomb monocaténaire de 2 à 4 nucléotides. La séquence reconnue par l'enzyme de restriction est une séquence de quatre à huit nucléotides qui est un palindrome. Comme avec un mot palindrome, cela signifie que la séquence se lit de la même manière en avant et en arrière. Dans la plupart des cas, la séquence se lit de la même manière en avant sur un brin et en arrière sur le brin complémentaire. Lorsqu'une coupe décalée est effectuée dans une séquence comme celle-ci, les surplombs sont complémentaires (Figure 10.5).

Parce que ces surplombs sont capables de se réunir par liaison hydrogène avec des surplombs complémentaires sur un morceau d'ADN coupé avec la même enzyme de restriction, on les appelle « extrémités collantes ». Le processus de formation de liaisons hydrogène entre des séquences complémentaires sur des brins simples pour former un ADN double brin est appelé annelage. L'ajout d'une enzyme appelée ADN ligase, qui participe à la réplication de l'ADN dans les cellules, rejoint définitivement les fragments d'ADN lorsque les extrémités collantes se rejoignent. De cette manière, tout fragment d'ADN peut être épissé entre les deux extrémités d'un ADN plasmidique qui a été coupé avec la même enzyme de restriction (Figure 10.6).

Les plasmides contenant de l'ADN étranger sont appelés molécules d'ADN recombinant car ils contiennent de nouvelles combinaisons de matériel génétique. Les protéines produites à partir de molécules d'ADN recombinant sont appelées protéines recombinantes. Tous les plasmides recombinants ne sont pas capables d'exprimer des gènes. Les plasmides peuvent également être modifiés pour exprimer des protéines uniquement lorsqu'ils sont stimulés par certains facteurs environnementaux, afin que les scientifiques puissent contrôler l'expression des protéines recombinantes.

Clonage reproductif

Le clonage reproductif est une méthode utilisée pour créer un clone ou une copie identique d'un organisme multicellulaire entier. La plupart des organismes multicellulaires subissent une reproduction par voie sexuée, ce qui implique l'apport d'ADN de deux individus (parents), ce qui rend impossible la génération d'une copie identique ou d'un clone de l'un ou l'autre des parents. Les progrès récents de la biotechnologie ont permis de cloner des mammifères de manière reproductive en laboratoire.

La reproduction sexuée naturelle implique l'union, lors de la fécondation, d'un spermatozoïde et d'un ovule. Chacun de ces gamètes est haploïde, ce qui signifie qu'ils contiennent un ensemble de chromosomes dans leur noyau. La cellule résultante, ou zygote, est alors diploïde et contient deux ensembles de chromosomes. Cette cellule se divise par mitose pour produire un organisme multicellulaire. Cependant, l'union de deux cellules ne peut produire un zygote viable. Il existe des composants dans le cytoplasme de l'ovule qui sont essentiels au développement précoce de l'embryon au cours de ses premières divisions cellulaires. Sans ces dispositions, il n'y aurait pas de développement ultérieur. Par conséquent, pour produire un nouvel individu, un complément génétique diploïde et un cytoplasme d'œuf sont nécessaires. L'approche pour produire un individu cloné artificiellement consiste à prélever l'ovule d'un individu et à retirer le noyau haploïde. Ensuite, un noyau diploïde provenant d'une cellule du corps d'un deuxième individu, le donneur, est introduit dans l'ovule. L'œuf est ensuite stimulé pour se diviser afin que le développement se poursuive. Cela semble simple, mais en fait, il faut de nombreuses tentatives avant que chacune des étapes soit terminée avec succès.

Le premier animal agricole cloné était Dolly, une brebis née en 1996. Le taux de réussite du clonage reproductif à l'époque était très faible. Dolly a vécu six ans et est décédée d'une tumeur au poumon (figure 10.7). Il y avait des spéculations que parce que l'ADN cellulaire qui a donné naissance à Dolly provenait d'un individu plus âgé, l'âge de l'ADN peut avoir affecté son espérance de vie. Depuis Dolly, plusieurs espèces d'animaux (comme les chevaux, les taureaux et les chèvres) ont été clonées avec succès.

Il y a eu des tentatives pour produire des embryons humains clonés comme sources de cellules souches embryonnaires. Dans la procédure, l'ADN d'un humain adulte est introduit dans un ovule humain, qui est ensuite stimulé pour se diviser. La technologie est similaire à celle qui a été utilisée pour produire Dolly, mais l'embryon n'est jamais implanté dans une mère porteuse. Les cellules produites sont appelées cellules souches embryonnaires car elles ont la capacité de se développer en de nombreux types de cellules différentes, telles que des cellules musculaires ou nerveuses. Les cellules souches pourraient être utilisées pour la recherche et finalement fournir des applications thérapeutiques, telles que le remplacement de tissus endommagés. L'avantage du clonage dans ce cas est que les cellules utilisées pour régénérer de nouveaux tissus correspondraient parfaitement au donneur de l'ADN d'origine. Par exemple, un patient atteint de leucémie n'aurait pas besoin d'un frère ou d'une sœur avec un tissu compatible pour une greffe de moelle osseuse.

Connexion visuelle

Pourquoi Dolly était-elle une Finn-Dorset et non une brebis écossaise Blackface ?

Ingénierie génétique

L'utilisation de la technologie de l'ADN recombinant pour modifier l'ADN d'un organisme afin d'obtenir des traits souhaitables s'appelle le génie génétique. L'ajout d'ADN étranger sous la forme de vecteurs d'ADN recombinant générés par clonage moléculaire est la méthode la plus courante de génie génétique. Un organisme qui reçoit l'ADN recombinant est appelé organisme génétiquement modifié (OGM). If the foreign DNA that is introduced comes from a different species, the host organism is called transgenic . Bacteria, plants, and animals have been genetically modified since the early 1970s for academic, medical, agricultural, and industrial purposes. These applications will be examined in more detail in the next module.

Concepts en action

Watch this short video explaining how scientists create a transgenic animal.

Although the classic methods of studying the function of genes began with a given phenotype and determined the genetic basis of that phenotype, modern techniques allow researchers to start at the DNA sequence level and ask: "What does this gene or DNA element do?" This technique, called reverse genetics , has resulted in reversing the classical genetic methodology. One example of this method is analogous to damaging a body part to determine its function. An insect that loses a wing cannot fly, which means that the wing’s function is flight. The classic genetic method compares insects that cannot fly with insects that can fly, and observes that the non-flying insects have lost wings. Similarly in a reverse genetics approach, mutating or deleting genes provides researchers with clues about gene function. Alternately, reverse genetics can be used to cause a gene to overexpress itself to determine what phenotypic effects may occur.

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    • Authors: Samantha Fowler, Rebecca Roush, James Wise
    • Éditeur/site Web : OpenStax
    • Book title: Concepts of Biology
    • Date de parution : 25 avril 2013
    • Lieu : Houston, Texas
    • Book URL: https://openstax.org/books/concepts-biology/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/concepts-biology/pages/10-1-cloning-and-genetic-engineering

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    Osama bin Laden: The Science of His End

    "DNA is a charged molecule. Consequently, DNA molecules will move when an electrical field is applied to a liquid in which they are dissolved. If the liquid is a simple one--such as water with some salts in it--all the DNA molecules move at nearly the same speed. Under those conditions, it is hard to distinguish the tiny disparities in the motion of different kinds of DNA.

    "If the solution is made less liquid, as in a gel, and the DNA molecules all start moving across the solution from some initial small volume--that is, from essentially the same staring point--then the molecules can move at perceptibly different speeds. Usually smaller DNA molecules move faster than larger ones. After a while, the molecules are separated by size. If the molecules fall into only a few discreet sizes, then bands (little rectangles) of DNA will appear in the gel. Each of these bands contains DNA strands of a specific size."

    [Editors note: DNA fingerprinting uses gel electrophoresis to distinguish between samples of the genetic material. The human DNA molecules are treated with enzymes that chop them at certain characteristic points, thereby reducing the DNA to a collection of more manageably sized pieces. The DNA fragments are loaded into a gel and placed in an electrical field, which electrophoretically sorts the DNA fragments into various bands. These bands can be colored with a radioactive dye to make them visible to imaging techniques.]

    "For individual people, the bands of DNA created through this process will have a pattern that is specific to the individual. Part of this pattern comes from the size of the DNA part of it comes from the sequence of the DNA of a specific size.


    Voir la vidéo: ELECTROPHORESE SUR GEL DAGAROSE. Séparation et analyse des acides nucléiques. Biochimie Facile (Octobre 2022).