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Colorant cellulaire dans le spectre de fluorescence rouge

Colorant cellulaire dans le spectre de fluorescence rouge


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Il existe des colorants cellulaires disponibles pour la coloration des cellules par voie intracellulaire/membranaire. Je connais d'autres canaux (CFSE PKH26). Mais je veux colorer les cellules pour la cytométrie en flux avec un colorant "rouge". J'ai examiné quelques options de Thermo mais je n'ai pas trouvé de données suffisantes sur l'une ou l'autre.

Plus précisément, je prévois de colorer une seule population cellulaire avec deux colorants différents, de traiter chaque population colorée quelque peu différemment entre les deux, puis de les cultiver ensemble et de distinguer les lectures plus tard. La coloration des anticorps pour un marqueur de surface serait possible avec des fragments Fab (les anticorps eux-mêmes peuvent interférer avec l'activation des cellules pendant la culture). Par conséquent, je préférerais utiliser un colorant à spectre rouge comme CFSE ou PKH26 car cela peut être moins cher et possible pour une utilisation secondaire avec d'autres lignées cellulaires.

J'ai plusieurs cytomètres disponibles et l'émittance spécifique n'a pas d'importance car nous pouvons choisir ce qui est généralement possible (LSR/Fortessa).

Ainsi, je recherche un colorant avec émittance dans le spectre de fluorescence rouge qui dispose de protocoles de coloration pouvant être adaptés à mes besoins.

Quelqu'un est-il prêt à partager ses expériences ?

Éditer

  • Clarifié que j'avais besoin d'une "coloration sans anticorps"
  • Question clarifiée par rapport à la question biologique et FACS

J'ai utilisé la marque ThermoFisher de colorants CellTrace. Plus précisément, j'ai co-cultivé deux populations de cellules, une avec CellTrace Far Red dans le canal APC et une autre avec CellTrace Yellow dans le canal PE. Mon choix a été en partie guidé par une revue de produit par un autre laboratoire vantant la cytotoxicité relativement faible de ces produits.

Le protocole est assez simple. Il est également disponible en CFSE et Violet, bien que je ne les ai pas testés. Ces colorants sont également optimisés pour les lymphocytes, et je vous recommande donc de titrer si vous colorez autre chose.

Les colorants sont assez brillant, et il y avait donc des problèmes avec la costaine APC-Cy7, par exemple. J'ai fini par laisser mes colorants CellTrace comme seuls marqueurs sur leurs lasers respectifs et empiler mon phénotypage sur les lasers 355 nm et 405 nm.

Pour une compensation, vous pouvez simplement vous en tenir aux cellules, mais dans le manuel du produit pour CellTrace, cependant, il est dit :

"Les réactifs CellTrace™ diffusent facilement dans les cellules et se lient de manière covalente aux amines intracellulaires, ce qui donne une coloration fluorescente stable et bien conservée qui peut être fixée avec des fixateurs aldéhydes."

Donc, si vous utilisez les perles de composition réactives aux amines ArC pour les kits LIVE/DEAD, vous pourrez peut-être simplement créer des perles de composition avec celles-ci. Je vérifierai cela quand je serai de retour au travail si besoin, car je ne l'ai pas fait moi-même, mais c'est une bonne idée !


Il existe un certain nombre de colorants différents, comme vous pouvez le voir sur cette figure (à partir d'ici) :

Un bon aperçu peut être trouvé dans la publication de note d'application "Sélection des réactifs pour la cytométrie en flux multicolore" de BD (dans la référence 1) et également dans les spécifications du fluorochrome de BD (référence 2).

Les références:

  1. Sélection des réactifs pour la cytométrie en flux multicolore
  2. Spécifications du fluorochrome BD Life Sciences