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B3. Chymotrypsine - Biologie

B3. Chymotrypsine - Biologie


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La chymotrypsine, une protéase, clive les amides ainsi que les petits substrats esters après les résidus aromatiques. Les données suivantes utilisant différents substrats de la chymotrypsine suggèrent qu'un intermédiaire covalent se produit sur le clivage catalysé par la chymotrypsine des esters et des amides.

Changer le substrat (par exemple, changer le groupe partant ou les substituants acyle d'un substrat hydrolysable)

Clivage du substrat de la chymotrypsine, 25oC, pH 7,9
constantes cinétiquesAcétyl-Tyr-Gly-amideEster d'acétyl-Tyr-O éthyleEster/Amide
(k_{chat}) (s-1)0.50193390
(K_m) (M)0.0230.00070.03
( dfrac{k_{cat}}{K_m}) (M-1s-1)22280,00012,700
Constantes cinétiques pour le clivage de la chymotrypsine des dérivés de N-acétyl-L-Trp - N-acétyl-L-Trp-X
X (k_{chat}) (s-1)(K_m) x 103 (M)
-OCH2CH3270.097
-OCH3280.095
-p-nitrophénol310.002
-NH20.0267.3
  1. les (k_{cat}) et (k_{cat}/K_m) sont plus grands et les (K_m) plus petits pour les substrats esters par rapport aux substrats amides, suggérant que les amides sont plus difficiles à hydrolyser (tableaux 1 et 2 ci-dessus). Ceci est attendu étant donné le groupe partant plus pauvre de l'amide.
  2. le (k_{cat}) pour l'hydrolyse des substrats esters ne dépend pas de la nature du groupe partant (c'est-à-dire s'il s'agit d'un groupe partant plus pauvre tel que le méthoxy ou d'un meilleur groupe partant tel que le p-nitrophénolate) suggérant que cette étape n'est pas l'étape limitant la vitesse pour le clivage de l'ester (tableau 2). Sans l'enzyme, les esters p-nitrophényliques sont clivés beaucoup plus rapidement que les esters méthyliques. Par conséquent, la désacylation doit être limitante. Mais désacylation de quoi ? Si l'eau était le nucléophile, la libération du groupe partant entraînerait la formation simultanée du groupe carboxyle libre et de l'amine. Ceci suggère un intermédiaire covalent acyl-enzyme.
  3. Lorsque l'extrémité acyle du substrat ester est modifiée, sans changer le groupe partant (un groupe p-nitrophényle), un intermédiaire covalent peut être piégé. Plus précisément, la désacylation d'un groupe triméthylacétyle est beaucoup plus lente que celle d'un groupe acétyle. Il est si lent qu'un intermédiaire de chymotrypsine marqué au triméthylacétyle marqué au 14C peut être isolé après incubation de la chymotrypsine avec du p-nitrophényltriméthylacétate marqué au 14C en utilisant une chromatographie par filtration sur gel.

Nous avons déjà vu un mécanisme cinétique compatible avec ces idées. Les équations de réaction sont présentées ci-dessous :

Dans cette réaction, un substrat (S) pourrait interagir avec (E) pour former un complexe, qui est ensuite clivé en produits (P) et (Q). (Q) est libéré de l'enzyme, mais (P) peut rester attaché de manière covalente, jusqu'à ce qu'il soit expulsé. Ceci est conforme exactement au mécanisme décrit ci-dessus.; Pour le clivage catalysé par la chymotrypsine, l'étape caractérisée par (k_2) est l'étape d'acylation (avec libération du groupe partant tel que le p-nitrophénol dans le laboratoire 5). L'étape caractérisée par (k_3) est l'étape de désacylation dans laquelle l'eau attaque l'enzyme acyle pour libérer le produit (P). En classe et pour les devoirs, vous avez dérivé l'équation suivante :

[ v = dfrac{k_2k_3}{k_2 + k_3} E_oS/[K_s(k_3)/(k_2+k_3)] + S label{7}]

Comme mentionné ci-dessus, pour l'hydrolyse des substrats esters, qui ont de meilleurs groupes partants par rapport aux amides, la désacylation est limitante, ((k_3 ll k_2)). Alors l'équation ( ef{7}) devient

[ v = k_3EoS/[K_s(k_3)/(k_2) + S]]

[V_m = k_3E_o]

et

[K_m = K_s dfrac{k_3}{k_2}]

Pour l'hydrolyse des amides, comme mentionné ci-dessus, l'acylation peut être limitante ((k_2 ll k_3)). Alors l'équation 7 devient :

[v = dfrac{k_2EoS}{K_s+ S}]

[V_m = k_2E_o] et [K_m = K_s]

Tout comme nous l'avons vu précédemment pour l'hypothèse d'équilibre rapide (lorsque (ES) se désagrège en (E) + (S) plus rapidement qu'il ne va au produit), (K_m = K_s) dans l'hydrolyse des amides .

Noter

Un nouveau programme informatique théorique, appelé THEMATICS (courbes de titrage microscopiques théoriques) a été développé pour calculer les courbes de titrage pour tous les groupes ionisables dans une protéine. Lorsqu'ils sont effectués sur des protéines de test, les acides aminés qui présentent des courbes anormales (aplaties par rapport aux courbes de titrage normales) se trouvent généralement dans le site actif de la protéine. Les courbes aplaties montrent que l'acide aminé est partiellement protoné sur une plage de pH plus large que celle théoriquement attendue. Le programme peut être utilisé pour prédire les régions de sites actifs sur des protéines de structure connue mais de fonction inconnue, et sera utile dans le domaine émergent de la protéomique. (figure ci-dessous de Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, Numéro 22, 12473-12478, 23 octobre 2001)

Figure 1. Exemples de courbes de titrage théoriques. Charge nette moyenne prévue en fonction du pH. (A) Tous les résidus histidine dans la chaîne A de TIM : His-26 (+), His-95 (�), His-100 (*), His-115 (carré vide), His-185 ( carré plein), His-195 (cercle vide), His-224 (cercle plein) et His-248 (). (B) Résidus tyrosine sélectionnés de AR : Tyr-39 (+), Tyr-48 (�), Tyr-177 (*), Tyr-291 (carré vide) et Tyr-309 (carré plein). (C) Résidus lysine sélectionnés de PMI : Lys-100 (+), Lys-117 (�), Lys-128 (*), Lys-136 (carré vide) et Lys-153 (carré plein). TIM, triosephosphate isomérase; AR, aldose réductase; PMI, phosphomannose isomérase. N'oubliez pas qu'en fonction du microenvironnement protéique, le pKa d'une chaîne latérale comme Asp peut varier de 0,5 à 9,2 !

Figure : phosphofluorate de diisopropyle

Le malathion et l'éthyl parathion (pesticides à base de phosphate organique) ont des structures et des réactivités similaires à celles du DIPF et inhibent sélectivement les protéases à sérine chez les insectes.

Figure : tos-L-Phe-chlorométhyl cétone

Figure : Mécanisme de protéase à sérine

Bref, tous les mécanismes catalytiques que nous avons rencontrés précédemment sont en jeu dans la catalyse de la chymotrypsine. Ceux-ci incluent la catalyse nucléophile (avec le Ser 195 formant un intermédiaire covalent avec les substrats), la catalyse acide/base générale avec His 57, et plus ou moins, la catalyse électrostatique avec Asp 102 stabilisant non pas l'état de transition ou intermédiaire, mais la forme protonée de His 57 Un point important à noter est que His, en tant que catalyseur acide et basique général, stabilise non seulement les charges en développement dans l'état de transition, mais fournit également une voie pour le transfert de protons, sans laquelle les réactions auraient des difficultés à se dérouler.

Figure : trou d'oxyanion dans les protéases à sérine : stabilisation du TS

Un dernier mécanisme est à l'œuvre. L'enzyme se lie en effet plus étroitement à l'état de transition que le substrat. Les structures cristallines avec de mauvais substrats "pseudo" qui sont piégés en tant que substrats partiellement déformés tétraédriquement de l'enzyme et avec des inhibiteurs montrent que l'intermédiaire oxyanion, et donc vraisemblablement le TS, peut former des liaisons H avec l'amide H (de la chaîne principale ) de Gly 193 et ​​Ser 195. Ceux-ci ne peuvent pas être réalisés sur le substrat hybride trigonal sp2. Dans l'enzyme seule, le trou dans lequel l'intermédiaire oxyanion et le TS seraient placés n'est pas occupé. Ce trou d'oxyanion est occupé dans l'intermédiaire tétraédrique.

Liens web:

Page d'accueil de la sérine protéase

Jmol : Mise à jour du complexe Chymotrypsine:D-Leu-L-Phe-p-fluorobenzylamde Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Jmol : Mise à jour du complexe inhibiteur de chymotrypine-phényléthylboronate Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

De nombreuses enzymes ont des sérines à site actif qui agissent comme des catalyseurs nucléophiles dans les réactions de substitution nucléophile (généralement l'hydrolyse). L'une de ces enzymes est l'acétylcholine estérase qui clive le neurotransmetteur acétylcholine dans la synapse de la jonction neuromusculaire. L'émetteur entraîne une contraction musculaire lorsqu'il se lie à son récepteur à la surface des cellules musculaires. L'émetteur ne doit pas rester trop longtemps dans la synapse, sinon la contraction musculaire se poursuivra de manière incontrôlée. Pour éviter cela, une enzyme hydrolytique, l'acétylcholine estérase, une sérine estérase présente dans la synapse, clive le transmetteur, à des vitesses proches du contrôle de la diffusion. Le diisopropylphosphofluoridate (DIPF) inhibe également cette enzyme, ce qui en fait un puissant agent de guerre chimique. Un inhibiteur encore plus fluoré de cette enzyme, le sarin, est l'agent chimique létal le plus puissant connu de cette classe. Seulement 1 mg est nécessaire pour tuer un être humain.

Figure : sarin


Voir la vidéo: Enzyme cofactors and coenzymes. Biology. Khan Academy (Février 2023).